Algunas reacciones entre azúcares y otros reactivos químicos generan productos con color. La intensidad del color está relacionada con la concentración inicial de azúcares. La absorbancia de soluciones de muestras se puede medir y comparar con la absorbancia de soluciones patrón de concentración de azúcar conocida. En el caso de polisacáridos sólo se conoce un número limitado de reacciones que implican cambios de color, y la mayoría de ellas implican azúcares sencillos, normalmente azúcares reductores (ver tabla).
La determinación de glucosa se escogió principalmente porque los estudiantes saben que son los azúcares, y por tanto la actividad tiene un interés general. Además, la determinación del contenido de azúcares en mermeladas puede tener interés en aplicaciones industriales en cuestiones relacionadas con control de calidad.
Uno de los método para la determinación de la concentración de azúcar en mermelada implica la hidrólisis de muchos de los azúcares no reductores (en mermelada principalmente sacarosa) en glucosa, utilizando ácido sulfúrico (H2SO4) y subsiguiente neutralización con hidróxido de sodio (NaOH). Los azúcares reductores (por ejemplo glucosa y fructosa) generan un producto rojo-marrón cuando son calentados en presencia de ácido 3,5 – dinitrosalicílico (DNSA, también conocido como ácido 2-hidroxi-3 ,5-dinitrobenzoico). Para más detalles sobre esta reacción, consultar Miller (1959).
La concentración del complejo coloreado se puede determinar con el espectrofotómetro usando el LED azul (430 nm). La concentración inicial de azúcar en las muestras de mermelada se puede obtener de la curva de calibración creada a partir de concentraciones de glucosa conocida.
Equipos y reactivos
- Espectrofotómetro Spektra (o otro espectrofotómetro)
- Cubetas o blisteres
- Pipetas
- Matraces aforados de 100 ml
- Erlenmeyers
- Tubos de medida
- Balanza
- Baño de agua
- Embudo
- Filtre de papel
- Muestras de mermelada
- Reactivo DNSA (ácido 3,5-dinitrosalicílico)
- Solución de ácido sulfúrico (H2SO4) (aproximadamente 2 moles/l)
- Solución de hidróxido de sodio (NaOH) (10% en peso)
- Tartrato de sodio y potasio (NaK(CH2OH)2(COO)2.4H2O)
- Glucosa en polvo (C6H12O6)
Preparación de les soluciones
Reactivo DNSA: para preparar el reactivo DNSA, disolver 10 g de DNSA en 200 ml de solución NaOH (aproximadamente 2 moles/l). Calentar la solución y mezclar perfectamente. Disolver 300 g de tartrato de sodio y potasio en 500 ml de agua destilada para obtener un estabilizante de color. Mezclar las dos soluciones, agitar y enrasar a 1 l con agua destilada.
Mermelada (sucres): pesar 1-2 g de mermelada en un erlenmeyer y añadir 10 ml de ácido sulfúrico. Calentar en el baño de agua hirviendo durante 20 min., agitando periódicamente hasta que la hidrólisis sea completa. Dejar enfriar la muestra y añadir cuidadosamente 12 ml de hidróxido de sodio. Agitar y filtrar a un matraz aforado de 100 ml, enrasar con agua destilada a 100 ml. Usando una pipeta, transferir 10 ml de esta solución a otro matraz aforado de 100 ml y enrasar a 100 ml con agua destilada para obtener la solución de medida. Agitar.
Mermelada (azúcares reductores): pesar 3.0 g de mermelada en un erlenmeyer. Añadir 50 ml de agua destilada. Calentar y agitar durante 10 min. Filtrar a un matraz aforado de 100 ml y enrasar a 100 ml con agua destilada. Usando una pipeta, transferir 10 ml a otro matraz aforado de 100 ml y enrasar a 100 ml con agua destilada para obtener la solución de medida. Agitar.
Solución estándar de glucosa (15 mg/ml): poner 1.5 g de glucosa en un matraz aforado de 100 ml y enrasar a 100 ml con agua destilada. Agitar.
Obtención de la curva de calibración
- Etiquetar cinco matraces aforados (100 ml) con letras de la A a la E. En cada matraz etiquetado, pipetear los volúmenes de solución estándar de glucosa y agua destilada especificados en la tabla 1.
| Matraz |
A |
B |
C |
D |
E |
Tabla 1: preparación de les soluciones estándar de glucosa
| Volumen de solución estándar de glucosa (ml) |
2 |
3 |
6 |
8 |
10 |
| Volumen de agua destilada (ml) |
98 |
97 |
94 |
92 |
90 |
|
Concentración de glucosa (mg/ml) |
0.3 |
0.45 |
0.9 |
1.2 |
1.5 |
2. Etiquetar y llenar seis tubos de muestra tal y como se especifica en la tabla 2.
| Número de la muestra |
Blanco |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
TTabla 2: preparación de les soluciones de la curva de calibración
| Solución estándar de glucosa (matraz) |
N/A |
A |
B |
C |
D |
E |
| Volumen de solución estándar de glucosa (ml) |
0 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
| Volumen de reactivo DNSA (ml) |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
| Volumen de agua destilada (ml) |
3 |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
Figura 4: Soluciones de
calibración
Imagen cortesía de Irena
Štrumbelj Drusany
- Calentar los tubos de medida y sus contenidos en agua hirviendo durante 5 min. El reactivo DNSA reacciona con los azúcares presentes, generando un producto rojo-marrón.
- Enfriar los tubos de medida, añadir 6 ml de agua destilada a cada tubo y agitar bien.
- Usando la luz azul del LED (430 nm) del espectrofotómetro, medir la transmitancia de cada solución.
Las lecturas del instrumento Spektra son transmitancias expresadas en porcentajes y tienen que dividirse entre 100 para obtener los valores de transmitancia para los cálculos siguientes. La transmitancia está relacionada con la absorbancia por la ecuación: A = –log T. Ver la segunda y tercera columna de la tabla 3.
La imagen de la derecha muestra las soluciones de calibración. Incluso el blanco (agua con DNSA sin glucosa) tiene un color intenso. Por lo tanto es necesario medir todas las muestras, incluyendo el blanco, contra agua destilada. La absorbancia específica de la glucosa en las muestras se calcula restando la medida de absorbancia del blanco de la medida de absorbancia de la muestra (consultar la cuarta columna de la tabla 3).
| Concentración de glucosa (mg/ml) |
Transmitancia (lectura del Spektra, T%) |
Absorbancia (A) |
Absorbancia específica de la glucosa (A – Ablanc) |
Tabla 3: curva de calibración- medidas de absorbancia de las muestras de diferentes concentraciones de glucosa
| 0 (Blank) |
27.54 |
0.56 |
0 |
| 0.3 |
23.44 |
0.63 |
0.07 |
| 0.45 |
20.04 |
0.69 |
0.13 |
| 0.9 |
18.21 |
0.74 |
0.18 |
| 1.2 |
15.13 |
0.82 |
0.26 |
| 1.5 |
14.45 |
0.84 |
0.28 |
6. Grafico de la concentración de glucosa contra la absorbancia específica de la glucosa, tal y come se muestra en la figura 5.
Figura 5: Curva de calibración de les muestras- absorbancia específica de la glucosa contra concentración de glucosa
Medida de las muestras de mermelada
Las muestras de mermelada deben ser tratadas de manera similar a las soluciones de glucosa utilizadas para la curva de calibración.
- Para cada muestra de mermelada a medir, colocar 1 ml de muestra de mermelada preparada (ver “Preparación de soluciones”) en un tubo de medida y añadir 1 ml de reactivo DNSA y 2 ml de agua destilada.
- Calentar los tubos de medida y sus contenidos en agua hirviendo durante 5 min. El reactivo DNSA reacciona con los azúcares presentes, generando un producto rojo-marrón.
- Enfriar los tubos, añadir 6 ml de agua destilada a cada tubo y agitar.
- Utilizando la luz azul LED (430 nm) del espectrofotómetro, medir la transmitancia (T%) de cada muestra de mermelada. Dividir entre 100 para obtener T, convertir T a A usando la ecuación A = –log T, i usar este valor para calcular la absorbancia específica de la glucosa (A- Ablanc).
La tabla 4 muestra un ejemplo de valores de transmitancia obtenidos y los valores de absorbancia específica de glucosa para cada muestra.
| Muestra |
Transmitancia
(lectura del Spektra, T%) |
Absorbancia
(A) |
Absorbancia específica de la glucosa
(A – Ablanc) |
Table 4: Sample results for jam samples
| 1 |
18.6 |
0.73 |
0.17 |
| 2 |
21.3 |
0.67 |
0.11 |
- Utilizando la curva de calibración, convertir les medidas de absorbancia (A) a concentraciones de glucosa (mg/ml) en vuestras muestras.
Siguiendo los ejemplos de la tabla 4, las concentraciones de glucosa obtenidas a partir de la curva de calibración son:
Muestra 1: 0.8 mg/ml
Muestra 2: 0.5 mg/ml
- A partir de les concentraciones de glucosa, calcular la masa de glucosa en 1 g de muestra usando la siguiente ecuación:
Masa de glucosa (g por 1g muestra) = masa concentración (mg/ml) x 10 x 100 ml
Donde:
Masa concentración es el valor leído en la curva de calibración
10 es la dilución (ver “Preparación de soluciones”)
100 ml es el volumen de 1 g de muestra de mermelada.
En nuestro ejemplo,
Muestra 1: masa de glucosa (g per 1 g de muestra) = 0.8 mg/ml x 10 x 100 ml = 0.8 g
Muestra 2: masa de glucosa (g per 1 g de muestra) = 0.5 mg/ml x 10 x 100 ml = 0.5 g.
Estos cálculos están hechos asumiendo que la masa inicial de mermelada es de 1 g. Si, por ejemplo, la muestra hubiera pesado 2 g, los resultados anteriores se dividirían entre 2 para obtener la masa de glucosa en g por 1 g de muestra.
