Nombre de reactions entre les sucres et des réactifs chimiques donnent des produits colorés; l’intensité de la couleur est fonction de la concentration initiale en sucre. On peut mesurer l’absorbance de solutions échantillons et la comparer à l’absorbance de solutions standard aux concentrations en sucre connues. On ne connaît qu’un nombre limité de réactions avec changement de couleur pour les polysaccharides, et la plupart impliquent des molécules simples, habituellement des sucres réducteurs (voir encadré).
Le dosage du glucose a été choisi avant tout parce que les élèves savent ce que sont les sucres – l’expérience est très bien perçue. En outre, le dosage du sucre dans la confiture peut avoir des applications industrielles dans des domaines comme le contrôle qualité.
Une méthode de dosage de la concentration de la confiture en sucre consiste à hydrolyser un certain nombre des sucres non réducteurs (principalement le sucrose dans la confiture) par addition d’acide sulfurique (H2SO4) puis neutralisation de l’échantillon à l’hydroxyde de sodium (NaOH). Les sucres réducteurs (c’est-à-dire le glucose et le fructose) chauffés avec de l’acide 3.5-dinitrosalicylique (ADNS, aussi connu sous le nom d’acide 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoïque) produisent un composé brun-rouge. Pour plus de détails sur cette réaction, voir Miller (1959).
On peut déterminer la concentration du complexe coloré à l’aide du spectromètre en utilisant la DEL en radiation bleue (430 nm): la concentration initiale en sucre des échantillons de confiture est lue sur une courbe d’étalonnage dressée à partir de concentrations en glucose connues.
Equipement et réactifs
- Spectromètre Spektra (ou autre)
- Cuvettes ou ‘blisters’
- Pipettes
- Eprouvettes graduées de 100 ml
- Fiole d’Erlenmeyer
- Tubes à essai
- Balance
- Bain-marie
- Entonnoir
- Papier filtre
- Echantillons de confitures
- Réactif ADNS (acide 3,5-dinitrosalicylique)
- Acide sulfurique en solution (H2SO4) (approximativement à 2 mol/l)
- Hydroxyde de sodium en solution (NaOH) (w = 10%)
- Tartrate double de sodium et de potassium (NaK(CH2OH)2(COO)2.4H2O)
- Glucose en poudre (C6H12O6)
Préparation des solutions
Réactif ADNS: Pour preparer le réactif ADNS, dissoudre 10 g d’ADNS dans 200 ml de solution de NaOH (à environ 2 mol/l). Chauffer la solution en agitant vigoureusement. Dissoudre 300 g de tartrate double de sodium et de potassium dans 500 ml d’eau distillée pour obtenir un stabilisateur de couleur. Mélanger les deux solutions, bien agiter et compléter à 1 l avec de l’eau distillée.
Confiture (sucres): Mettre 1 à 2 g de confiture dans une fiole d’Erlenmyer et ajouter 10 ml d’acide sulfurique. Chauffer au bain-marie bouillant pendant 20 minutes, en agitant régulièrement jusqu’à hydrolyse complète. Laisser refroidir l’échantillon et ajouter avec précaution 12 ml d’hydroxyde de sodium. Agiter et filtrer dans une éprouvette graduée de 100 ml, et compléter à 100 ml avec de l’eau distillée. Transférer 10 ml de la solution à l’aide d’une pipette dans une autre éprouvette graduée de 100 ml et compléter à 100 ml avec de l’eau distillée pour obtenir la solution test. Bien agiter.
Confiture (sucres réducteurs): Mettre 3.0 g de confiture dans une fiole d’Erlenmeyer, ajouter 50 ml d’eau distillée, chauffer en agitant pendant 10 minutes. Filtrer dans une éprouvette graduée de 100 ml et ajouter 100 ml d’eau distillée. Transférer 10 ml de la solution à l’aide d’une pipette dans une autre éprouvette graduée de 100 ml et compléter à 100 ml avec de l’eau distillée pour obtenir la solution test. Bien agiter.
Solution de glucose contrôlée (15 mg/ml): Mettre 1.5 g de glucose dans une éprouvette graduée de 100 ml et compléter à 100 ml avec de l’eau distillée? Agiter.
Etablissement de la courbe d’étalonnage
- Coller une etiquette avec les lettres A à E sur cinq éprouvettes graduées (100 ml). Injecter à la pipette dans chaque éprouvette étiquetée les volumes de solution de glucose standard et d’eau distillée spécifiés dans le Tableau 1.
Eprouvette |
A |
B |
C |
D |
E |
Tableau 1: Préparer les solutions de glucose standard
Volume de solution de glucos contrôlée (ml) |
2 |
3 |
6 |
8 |
10 |
Volume d’eau distillée (ml) |
98 |
97 |
94 |
92 |
90 |
Concentration en glucose (mg/ml) |
0.3 |
0.45 |
0.9 |
1.2 |
1.5 |
2. Etiqueter et remplir six tubes de test comme indiqué dans le Tableau 2.
Numéro de l’échantillo |
Essai à blanc |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
Tableau 2: Préparation des solutions pour la courbe d’étalonnage
Solution de glucose standard (éprouvette) |
N/A |
A |
B |
C |
D |
E |
Volume de solution de glucose standard (ml) |
0 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
Volume de réactif ADNS (ml) |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
Volume d’eau distillée (ml) |
3 |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
Figure 4: Les solutions
d’étalonnage
Illustration reproduite avec
l’aimable autorisation de Irena
Štrumbelj Drusany
- Chauffer les tubes de test et leurs contenus dans de l’eau bouillante pendant 5 minutes; le réactif ADNS réagira avec tout sucre present en donnant un produit rouge-brun.
- Refroidir les tubes de test, ajouter 6 ml d’eau distillée dans chacun et bien agiter.
- Mesurer le facteur de transmission de chaque solution à l’aide de la DEL en couleur bleue (430 nm) du spectromètre.
Les lectures faites sur le spectromètre Spektra sont celles de facteurs de transmission exprimés en pourcentage et doivent être divisées par 100 pour obtenir les valeurs de facteurs de transmission utilisés dans les calculs suivants. Le facteur de transmission (T) est lié à l’absorbance (A) selon l’équation : A = – Log T. Voir les deuxième et troisième colonnes du Tableau 3.
L’illustration sur la droite montre les solutions d’étalonnage; même l’essai à blanc (eau et ADNS sans glucose) est de couleur intense. Il est donc nécessaire de doser tous les échantillons, y compris celui à blanc, par rapport à de l’eau distillée. L’absorbance spécifique au glucose des échantillons est alors calculée en soustrayant la mesure d’absorbnce de l’essai à blanc de celle de l’échantillon (voir la quatrième collonne du Tableau 3).
Concentration en glucose (mg/ml) |
Facteur de transmission (lecture du Spektra, T%) |
Absorbance (A) |
Absorbance spécifique du glucose (A – Aessai à blanc) |
Tableau 3: Courbe d’étalonnage – mesures d’absorbance des échantillons à différentes concentration de solution de glucose
0 (Essai à blanc) |
27.54 |
0.56 |
0 |
0.3 |
23.44 |
0.63 |
0.07 |
0.45 |
20.04 |
0.69 |
0.13 |
0.9 |
18.21 |
0.74 |
0.18 |
1.2 |
15.13 |
0.82 |
0.26 |
1.5 |
14.45 |
0.84 |
0.28 |
6. Reporter la concentration en glucose en function de l’absorbance spécifique au glucose, comme indiqué sur la Figure 5.
Figure 5: Sample calibration curve – glucose-specific absorbance against concentration of glucose
Dosage des échantillons de confiture
Les échantillons de confiture doivent être manipulés comme indiqué pour les solutions de glucose utilisés pour dresser la courbe d’étalonnage.
- Pour chaque confiture à tester, mettre 1 ml d’échantillon de confiture préparé (voir ‘Préparation des solutions’) dans un tube à essai et ajouter 1 ml de réactif ADNS et 2 ml d’eau distillée.
- Chauffer le tube à essai et son contenu dans de l’eau bouillante pendant 5 minutes; le réactif ADNs réagira avec tout sucre présent en donnant un composé rouge-brun.
- Refroidir le tube à essai, ajouter 6 ml d’eau distillée et bien agiter.
- Mesurer à l’aide de la DEL de couleur bleue du spectromètre la valeur du facteur de transmission (T%) de l’échantillon. Diviser par 100 pour obtenir T, convertir T en A en utilisant l’équation A = – Log T, et prendre la valeur de A pour calculer l’absorbance spécifique du glucose (A – Aessai à blanc)
Le tableau 4 montre un exemple des valeurs du facteur de transmission obtenues et l’absorbance spécifique au glucose calculée pour l’échantillon.
Echantillon |
Facteur de transmission
(lecture du Spektra, T%) |
Absorbance
(A) |
Absorbance spécifique du glucose
(A – Aessai à blanc) |
Tableau 4: Résultats pour des échantillons de confiture
1 |
18.6 |
0.73 |
0.17 |
2 |
21.3 |
0.67 |
0.11 |
- Convertir la mesure d’absorbance (A) de l’échantillon en concentration de glucose (mg/ml) en utilisant la courbe d’étalonnage.
Si l’on utilise les exemples du Tableau 4, les concentrations en glucose tirées de la courbe d’étalonnage donnent:
Echantillon 1: 0.8 mg/ml
Echantillon 2: 0.5 mg/ml
6. Calculer la masse de glucose dans 1 g d’échantillon de confiture à partir des concentrations en glucose en utilisant l’équation suivante:
Masse de glucose (en g par g d’échantillon) = concentration en masse (mg/ml) x 10 x 100 ml
où
La concentration en masse est la valeur lue sur la courbe d’étalonnage
10 est la dilution (voir ‘Préparation des solutions’)
100 ml est le volume d’1 g d’échantillon de confiture.
Dans l’exemple,
Echantillon 1: masse de glucose (en g par g d’échantillon) = 0.8 mg/ml x 10 x 100 ml = 0.8 g
Echantillon 2: masse de glucose (en g par G d’échantillon) = 0.5 mg/ml x 10 x 100 ml = 0.5 g.
Les calculs ci-dessus partent de l’hypothèse que l’échantillon initial de confiture était de 1 g. Si, par exemple, le poids de l’échantillon avait été de 2 g, il aurait fallu diviser par 2 les chiffres ci-dessus pour obtenir la masse d eglucose en g par g d’échantillon.