Un număr de reacții între zaharuri și alți reactivi chimici au ca rezultat produși colorați; intensitatea culorii este corelată cu concentrația inițială a zaharului. Absorbanța soluțiilor probă poate fi măsurată și comparată cu absorbanța soluțiilor standard cu concentrații de zahăr cunoscute. Este cunoscut doar un număr limitat de reacții de schimbare a culorii polizaharidelor și majoritatea implică zaharuri simple, de regulă zaharuri reducătoare (vezi caseta).
Determinarea glucozei a fost aleasă în primul rând deoarece elevii cunosc ce sunt zaharurile – activitatea prezentând astfel un interes larg. Mai mult, determinarea conținutului de zaharuri în gem poate avea aplicații industriale prin aspectele legate de controlul calității produselor.
O metodă de a determina concentrația zaharurilor din gem implică hidroliza mai multor zaharuri nereducătoare (în cazul gemului, în principal sucroza) în glucoză folosind acidul sulfuric (H2SO4), după care proba este neutralizată cu hidroxid de sodiu (NaOH). Atunci când sunt încălzite cu acid 3,5 – dinitrosalicilic (DNSA; cunoscut și sub numele de acid 2-hidroxi-3,5-dinitrobenzoic) zaharurile reducătoare (de ex. glucoza și fructoza) duc la un produs roșu-maroniu. Pentru mai multe detalii referitor la această reacție vezi Miller (1959).
Concentrația complexului colorant poate fi determinată cu ajutorul spectrometrului folosind lumina albastră a LED-ului (430 nm): concentrația inițială de zaharuri în probele de gem poate fi citită din curba de calibrare obținută folosind concentrațiile cunoscute ale glucozei.
Echipament și reactivi
- Spectrometru Spektra (sau un alt spectrometru)
- Cuve sau bule
- Pipete
- Recipiente volumetrice de 100 ml
- Recipiente conice
- Tuburi de testare
- Balanță
- Baie de apă
- Pâlnie
- Hârtie de filtru
- Porbe de gem
- Reactiv DNSA (acid 3,5 dinitrosalicilic)
- Soluție de acid sulfuric (H2SO4) (aproximativ 2 mol/l)
- Soluție de hidroxid de sodiu (NaOH) (w=10%)
- Tartrat de sodiu și potasiu (NaK(CH2OH)2(COO)2.4H2O)
- Pudră de glucoză (C6H12O6)
Prepararea soluțiilor
Reactivul DNSA: Pentru a prepara reactivul DNSA dizolvați 10 g DNSA în 200 ml de soluție NaOH (cca 2 mol/l). Încălziți soluția și agitați continuu cu grijă. Dizolvați 300 g tartrat de sodiu și potasiu în 500 ml de apă distilată pentru a obține un stabilizator de culoare. Combinați cele două soluții, amestecați bine și umpleți până la 1 l cu apă distilată.
Gem (zaharuri): Cântăriți 1 – 2 g de gem într-un recipient conic și adăugați 10 ml de acid sulfuric. Încălziți apoi într-o baie de apă timp de 20 min amestecând periodic până când hidroliza este completă. Lăsați proba să se răcească și adăugați cu grijă 12 ml de hidroxid de sodiu. Amestecați și filtrați într-un recipient cu volumul de 100 ml și umpleți apoi cu apă distilată. Folosind o pipetă transferați 10 ml de soluție într-un alt recipient cu volumul de 100 ml și umpleți din nou până la vârf pentru a produce soluția test. Amestecați bine.
Gem (zaharuri reducătoare): Cântăriți 3.0 g de gem într-un recipient conic, adăugați 50 ml de apă distilată și apoi încălziți amestecând timp de 10 min. Filtrați produsul într-un recipient cu volumul de 100 ml și umpleți cu vârf cu apă distilată. Folosind o pipetă transferați 10 ml de soluție într-un alt recipient cu volumul de 100 ml și umpleți din nou cu apă distilată pentru a obține soluția test. Amestecați bine.
Soluția stoc de glucoză (15 mg/ml): Adăugați 1.5 g de glucoză într-un vas cu volumul de 100 ml, apoi umpleți până la vârf cu apă distilată. Amestecați.
Realizarea curbei de calibrare
- Marcați cinci recipiente, având fiecare volumul de 100 ml, cu litere de la A la E. În fiecare recipient astfel marcat adăugați cu ajutorul unei pipete volumele de soluție standard de glucoză și apă distilată respectând indicațiile specificate în Tabelul 1.
| Recipient |
A |
B |
C |
D |
E |
Tabelul 1: Prepararea soluțiilor standard de glucoză
| Volumul soluției de glucoză stoc (ml) |
2 |
3 |
6 |
8 |
10 |
| Volumul de apă distilată (ml) |
98 |
97 |
94 |
92 |
90 |
|
Glucose concentration (mg/ml) |
0.3 |
0.45 |
0.9 |
1.2 |
1.5 |
2. Marcați și umpleți șase tuburi de testare așa cum este specificat în Tabelul 2.
| Numărul probei |
Martor |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
Table 2: Preparing the solutions for the calibration curve
| Soluția standard de glucoză (recipient) |
N/A |
A |
B |
C |
D |
E |
| Volumul soluției standard de glucoză (ml) |
0 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
| Volumul de reactiv DNSA (ml) |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
| Volumul de apă distilată (ml) |
3 |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
Figure 4: The calibration
solutions
Image courtesy of Irena
Štrumbelj Drusany
- Încălziți tuburile de testare și conținutul lor în apă care fierbe timp de 5 min; reactivul DNSA va reacționa cu orice cantitate de zaharuri prezentă și va rezulta un podus roșu-maroniu.
- Răciți tuburile de testare, adăugați 6 ml de apă distilată în fiecare recipient și apoi agitați bine.
Folosind lumina albastră (430 ml) produsă de LED-ul spectrometrului măsurați transmitanța fiecărei soluții.
Citirile de pe instrumentul Spektra sunt transmitanțe exprimate în procente și ar trebui să fie împărțite la 100 pentru a obține valorile transmitanței care vor fi utilizate în calculele viitoare. Transmitanța este legată de absorbanță conform relației: A = –log T. Vezi coloanele a doua și a treia din Tabelul 3.
Imaginea din dreapta prezintă soluțiile de calibrare; chiar și proba martor (apă cu DNSA fără glucoză) are o culoare intensă. De aceea este necesar să se măsoare toate probele, inclusive proba martor, în comparație cu apa distilată. Absorbanța specifică glucozei din probe este apoi calculată prin scăderea valorii măsurate a absorbanței probei martor din valoarea măsurată a absorbanței fiecărei probe (vezi coloana a patra a Tabelului 3).
| Concentrația glucozei (mg/ml) |
Transmitanța (citirea Spektra, T%) |
Absorbanța (A) |
Absorbanța specifică glucozei (A – Amartor) |
Tabelul 3: Curba de calibrare – măsurătorile absorbanței probei pentru diferite concentrații ale soluției de glucoză
| 0 (Blank) |
27.54 |
0.56 |
0 |
| 0.3 |
23.44 |
0.63 |
0.07 |
| 0.45 |
20.04 |
0.69 |
0.13 |
| 0.9 |
18.21 |
0.74 |
0.18 |
| 1.2 |
15.13 |
0.82 |
0.26 |
| 1.5 |
14.45 |
0.84 |
0.28 |
6. Trasați graficul concentrației glucozei în funcție de absorbanța specifică glucozei așa cum arată Figura 5.
Figura 5: Curba de calibrare – absorbanța specifică glucozei față de concentrația glucozei
Măsurarea probelor de gem
Probele de gem ar trebui tratate în mod asemănător cu tratarea soluțiilor de glucoză folosite pentru curba de calibrare.
- Pentru a testa fiecare tip de gem introduceți 1 ml de porbă preparată de gem (vezi ”Prepararea soluțiilor”) într-un tub de testare și adăugați 1 ml de reactiv DNSA și 2 ml de apă distilată.
- Încălziți tuburile de testare și conținutul lor în apă care fierbe timp de 5 min; reactivul DNSA va reacționa cu orice cantitate de zaharuri prezente rezultând un produs roșu-maroniu.
- Răciți tuburile de testare, adăugați 6 ml de apă distilată în fiecare tub și agitați bine.
- Folosind lumina albastră (430 nm) a LED-ului spectrometrului măsurați valoarea transmitanței (T%) fiecărei probe. Împărțiți cu 100 pentru a obține T, convertiți T în A folosind ecuația A = –log T și utilizați această valoare pentru a calcula absorbanța specifică glucozei (A – Ablank).
Tabelul 4 prezintă un exemplu cu valorile transmitanței obținute și cu absorbanța specifică glucozei pentru fiecare probă.
| Proba |
Transmitanța
(Citiri Spektra, T%) |
Absorbanța
(A) |
Absorbanța specifică a glucozei
(A – Ablank) |
Tabelul 4: Exemple de rezultate pentru probele de gem
| 1 |
18.6 |
0.73 |
0.17 |
| 2 |
21.3 |
0.67 |
0.11 |
- Folosind curba de calibrare pe care ați obținut-o transformați măsurătorile absorbanței (A) în concentrații ale glucozei (mg/ml) din probele voastre.
Folosind exemplele din Tabelul 4, valorile citite ale concentrațiilor glucozei din curba de calibrare dau:
Proba 1: 0.8 mg/ml
Proba 2: 0.5 mg/ml
6. Din concentrațiile glucozei calculați masa de glucoză din 1 g de probă de gem folosind următoarea ecuație:
Masa glucozei (g în 1g de probă) = concentrația masică (mg/ml) x 10 x 100 ml
Unde
concentrația masică este valoarea citită din curba de calibrare
10 este diluția (vezi ”Prepararea soluțiilor”)
100 ml este volumul a 1 g de probă de gem.
Pentru exemplul nostru,
Proba1: masa glucozei (g la 1 g de probă) = 0.8 mg/ml x 10 x 100 ml = 0.8 g
Proba 2: masa glucozei (g la 1g de probă) = 0.5 mg/ml x 10 x 100 ml = 0.5 g.
Calculele de mai sus consideră că proba inițială de gem a fost de 1 g. Dacă, de exemplu, proba a cântărit 2 g, valorile de mai sus trebuie împărțite la 2 pentru a obține masa de glucoză în g la 1 g de probă.
