Istnieje wiele reakcji chemicznych, w których cukry tworzą z reagentami zabarwione produkty. Intensywność barwy zależy od wyjściowego stężenia cukru. Dlatego pomiar absorbancji próbek i odniesienie do absorbancji roztworów wzorcowych może służyć do wyznaczania stężenia cukru. Tą metodą oznacza się przede wszystkim cukry proste (zwłaszcza cukry redukujące), dla których opisano wiele reakcji barwnych, ma ona mniejsze zastosowanie do oznaczania polisacharydów (see box).
Wybór glukozy był podyktowany przede wszystkim tym, że cukry są uczniom znane – ćwiczenie odnosi się do ich bezpośrednich doświadczeń z życia codziennego. Poza tym, oznaczanie zawartości cukrów w dżemach może mieć praktyczne zastosowanie w przemyśle, np. przy kontroli jakości.
Jedną z metod oznaczania cukrów w dżemie może być hydroliza nie-redukujących cukrów (głównie sacharozy) do glukozy przy pomocy kwasu siarkowego(VI) H2SO4, zobojętnieniu próbki wodorotlenkiem sodu NaOH i reakcji powstałych redukujących cukrów prostych (np. glukoza, fruktoza) z kwasem 3,5-dinitrosalilcylowym (DNSA, zwanym również kwasem 2-hydroksy-3,5-dinitrobenzoesowym). W wyniku tej reakcji, powstają czerwono-brązowe produkty. Dalsze informacje, p. Miller (1959).
Stężenie barwnych produktów określa się mierząc absorbancję roztworu za pomocą spektrometru używając niebieskiego światła diody (430 nm). Początkowe stężenie cukru w próbkach dżemu można odczytać z krzywej kalibracyjnej sporządzonej przy pomocy roztworów o znanym stężeniu glukozy.
Aparatura i odczynniki
- Spektrometr Spektra (lub inny spektrometr)
- Kiuwety lub blistry
- Pipety
- Kolby miarowe100 ml
- Kolby stożkowe
- Probówki
- Waga
- Łaźnia wodna
- Lejek
- Sączek bibułowy
- Próbki dżemu
- Odczynnik DNSA (kwas 3,5-dinitrosalicylowy)
- Sulphuric acid (H2SO4) roztwór (ok. 2 mol/l)
- Wodorotlenek sodu (NaOH), roztwór (ok. 10%)
- Winian sodowo-potasowy (NaK(CH2OH)2(COO)2.4H2O)
- Glukoza proszek (C6H12O6)
Przygotowanie roztworów
Odczynnik DNSA: Odważ 10 g DNSA i rozpuść go w 200 ml roztworu wodorotlenku sodu NaOH o stężeniu 2 mol/l. Ogrzej roztwór intensywnie mieszając. Przygotuj roztwór 300 g winianu sodowo-potasowego w 500 ml wody destylowanej. Zmieszaj oba roztwory w kolbie miarowej o pojemności 1000 ml i dopełnij wodą destylowaną do kreski miarowej.
Dżem (cukry): Odważ 1 – 2 g dżemu w kolbie stożkowej. Dodaj 10 ml roztworu kwasu siarkowego (VI). Ogrzewaj zawartość kolby na wrzącej łaźni wodnej przez 20 minut, mieszając od czasu do czasu, aż do zakończenia hydrolizy. Ochłodź mieszaninę i ostrożnie dodaj12 ml roztworu wodorotlenku sodu. Wymieszaj i przesącz powstałą mieszaninę do kolby miarowej o pojemności 100 ml, dopełnij wodą destylowaną do kreski miarowej. Za pomocą pipety przenieś 10 ml powstałego roztworu do innej kolby miarowej 100 ml i dopełnij wodą destylowana do kreski miarowej. Wymieszaj dobrze zawartość.
Dżem (cukry redukujące): Odważ 3,0 g dżemu w kolbie stożkowej, dodaj 50 ml wody destylowanej, ogrzewaj i mieszaj przez 10 minut. Mieszaninę przesącz do kolby miarowej o pojemności 100 ml, dopełnij wodą destylowaną do kreski miarowej. Za pomocą pipety przenieś 10 ml powstałego roztworu do innej kolby miarowej 100 ml i dopełnij wodą destylowana do kreski miarowej. Wymieszaj dobrze zawartość.
Bazowy roztwór wzorcowy glukozy (15mg/ml): Odważ 1,5 g glukozy, przenieś do kolby miarowej 100 ml, dodaj wody destylowanej do kreski miarowej i wymieszaj.
Przygotowanie krzywej kalibracyjnej
- Przygotuj 5 kolb miarowych o pojemności 100 ml i oznacz je lilterami A–E. Do każdej z nich odpowiednie objętości roztworu bazowego i wody destylowanej zgodnie z Tabelą 1.
| Kolba |
A |
B |
C |
D |
E |
Tabela 1: Przygotowanie wzorcowych roztworów glukozy
| Objętość bazowego roztworu glukozy (ml) |
2 |
3 |
6 |
8 |
10 |
| Objętość wody destylowanej (ml) |
98 |
97 |
94 |
92 |
90 |
|
Stężenie glukozy (mg/ml) |
0.3 |
0.45 |
0.9 |
1.2 |
1.5 |
2. Przygotuj sześć probówek i napełnij je zgodnie ze wskazówkami w Tabeli 2.
| Numer próbki |
Blank |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
Tabela 2: Przygotowanie roztworów do krzywej kalibracyjnej
| Wzorcowy roztwór glukozy (kolba) |
N/A |
A |
B |
C |
D |
E |
| Objętość wzorcowego roztworu glukozy (ml) |
0 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
| Objętość odczynnika DNSA (ml) |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
| Objętość wody destylowanej |
3 |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
Rysunek 4: Roztwory
kalibracyjne
Zdjęcie dzięki uprzejmości
Irena Štrumbelj Drusany
- Ogrzej probówki we wrzącej wodzie przez 5 minut, dzięki czemu zajdzie reakcja cukru z DNSA z utworzeniem czerwono-brązowego produktu.
- Ochłodź probówki, dodaj do każdej z nich po 6 ml wody destylowanej i dobrze wytrząśnij.
- Zmierz transmitancję powstałych roztworów używając niebieskiego światła diody (430nm).
Odczyty transmitancji z przyrządu Spektra, wyrażone w procentach, należy podzielić przez 100 aby otrzymać wartości transmitancji do dalszych obliczeń. Transmitancja jest związana z absorbancją równaniem: A = –logT. P. druga i trzecia kolumna w Tabeli 3.
Fotografia z prawej przedstawia roztwory kalibracyjne. Nawet roztwór odniesienia (woda i DNSA bez glukozy) jest intensywnie zabarwiony. Dlatego koniecznie należy mierzyć transmitancję wszystkich roztworów, również roztworu odniesienia, względem wody destylowanej. Absorbancję związaną z obecnością glukozy w próbce należy obliczyć odejmując zmierzoną wartość absorbancji próbki odniesienia od wartości absorbancji mierzonej próbki (p. kolumna czwarta Tabeli 3).
| Stężenie glukozy (mg/ml) |
Transmitancja (odczyt ze Spektra, T%) |
Absorbancja (A) |
Absorbancja związana z obecnością glukozy (A – Aodn) |
Tabela 3: Krzywa kalibracyjna – pomiary absorbancji próbek o różnym stężeniu glukozy
| 0 (Blank) |
27.54 |
0.56 |
0 |
| 0.3 |
23.44 |
0.63 |
0.07 |
| 0.45 |
20.04 |
0.69 |
0.13 |
| 0.9 |
18.21 |
0.74 |
0.18 |
| 1.2 |
15.13 |
0.82 |
0.26 |
| 1.5 |
14.45 |
0.84 |
0.28 |
6. Narysuj wykres zależności absorbancji związanej z obecnością glukozy względem stężenia, jak przedstawiono na Rysunek 5.
Rysunek 5: Krzywa kalibracyjna – absorbancja związana z obecnością glukozy względem stężenia glukozy
Pomiary dla próbek dżemu
Próbki dżemu należy przygotować podobnie jak roztwory glukozy wykorzystane do sporządzenia krzywej kalibracyjnej.
- Dla każdego rodzaju dżemu, umieść 1 ml przygotowanego roztworu dżemu (p. „Przygotowanie roztworów”) w probówce, dodaj 1 ml odczynnika DNSA i 2 ml wody destylowanej.
- Ogrzewaj zawartość probówki we wrzącej łaźni wodnej przez 5 minut. DNSA przereaguje z cukrami zawartymi w próbce z utworzeniem czerwono-brunatnych produktów.
- Ochłodź probówki, dodaj do każdej z nich po 6 ml wody destylowanej i dobrze wytrząśnij.
- Zmierz transmitancję (T%) powstałych roztworów używając niebieskiego światła diody (430nm). Odczyty podziel przez 100 aby otrzymać T, przekształć T w A przy pomocy równania A = –logT. Oblicz absorbancję związaną z obecnością glukozy (A – Aodn).
Tabela 4 przedstawia przykładowe wartości zmierzonej transmitancji oraz absorbancję próbek.
| Próbka |
Transmitancja
(odczyt ze Spektra, T%) |
Absorbancja
(A) |
Absorbancja związana z obecnością glukozy
(A – Aodn) |
Tabela 4: Wyniki dla próbek dżemu
| 1 |
18.6 |
0.73 |
0.17 |
| 2 |
21.3 |
0.67 |
0.11 |
- Przy pomocy krzywej kalibracyjnej przekształć wartości absorbancji (A) w wartości stężenia glukozy (mg/ml) w próbkach.
Dla przykładów w Tabeli 4, wartości stężenia glukozy odczytane z krzywej kalibracyjnej wynoszą:
Próbka 1: 0.8 mg/ml
Próbka 2: 0.5 mg/ml
6. Znając stężenia glukozy w próbkach, oblicz stężenie glukozy w dżemie za pomocą następującego równania:
Masa glukozy (na 1 g dżemu) = stężenie glukozy w próbce (mg/ml) x 10 x 100 ml
gdzie
stężenie glukozy w próbce jest wartością odczytaną z krzywej kalibracyjnej
10 oznacza rozcieńczenie (p. „Przygotowanie roztworów”)
100 ml jest objętością roztworu zawierającego 1 g dżemu.
W naszym przykładzie,
Próbka 1: masa glukozy (g na 1 g dżemu) = 0,8 mg/ml x 10 x 100 ml = 0,8 g
Próbka 2: masa glukozy (g na 1 g dżemu) = 0,5 mg/ml x 10 x 100 ml = 0,5 g.
Powyższe obliczenia zakładają, że wyjściowa próbka dżemu miała masę 1 g. Jeżeli, np. próbka ważyła 2 g, liczby powyżej należy podzielić przez 2 aby otrzymać masę glukozy zawartej w 1 g próbki.
