Zahlreiche Reaktionen zwischen Zuckern und chemischen Reagentien erzeugen gefärbte Produkte; die Farbintensität korreliert dabei mit der anfänglich vorhandenen Zuckerkonzentration. Die Absorption der Probe kann gemessen, und mit der Absorption von Standards mit bekannter Zuckerkonzentration verglichen werden. Für Polysaccharide gib es nur wenige geeignete Farbreaktionen, in der Regel spielen dabei einfache Zucker, meist reduzierende Zucker eine Rolle (siehe Box).
Die Glukosebestimmung wurde in erster Linie ausgewählt, weil der Versuch bei den Schüler/innen auf großen Anklang stößt, da sie Zucker kennen. Außerdem dürfte die Bestimmung des Zuckergehalts in Konfitüre für industrielle Anwendungen bedeutsam sein, z.B. für die Qualitätskontrolle.
Eine Möglichkeit die Zuckerkonzentration in Konfitüre zu bestimmen beruht auf der Hydrolyse vieler nicht-reduzierender Zucker (in Konfitüre hauptsächlich Saccharose) zu Glukose, üblicherweise unter der Verwendung von Schwefelsäure (H2SO4). Anschließend wird die Probe mit Natronlauge (NaOH) neutralisiert. Durch Erhitzen mit 3,5-Dinitrosalicylsäure (DNSA; auch als 2-Hydroxy-3,5-dinitrobenzoesäure bekannt) wird der Zucker unter Bildung eines rotbraunen Produkts reduziert (z.B. zu Glukose und Fruktose). Weitere Details, siehe Miller (1959).
Die Konzentration des gefärbten Komplexes kann mit dem Fotometer unter Verwendung der blauen Leuchtdiode (430 nm) bestimmt werden: die Ausgangskonzentration des Zuckers in der Konfitüre kann aus einer Kalibrationskurve, die durch Messung von Glukosestandards erstellt worden ist, ermittelt werden.
Geräte und Reagentien
- Spektro Fotometer (oder ein anderes Fotometer)
- Küvetten oder Blister
- Pipetten
- 100 ml Messkolben
- Erlenmeyerkolben
- Teströhrchen
- Waage
- Wasserbad
- Trichter
- Filterpapier
- Konfitüreproben
- DNSA Reagens (3,5-dinitrosalicylsäure)
- Schwefelsäure (H2SO4), etwa 2 mol/L
- Natronlauge (NaOH) (w=10%)
- Kaliumnatriumtartrat (NaK(CH2OH)2(COO)2.4H2O)
- Glukosepulver (C6H12O6)
Herstellung der Lösungen
DNSA reagent: Zur Herstellung des DNSA Reagens, 10 g DNSA in 200 ml NaOH (etwa 2 mol/l) auflösen, erhitzen und gut rühren. Zur Herstellung eines Farbstabilisators 300 g Kaliumnatriumtartrat in 500 ml destilliertem Wasser auflösen. Die beiden Lösungen vereinigen, gut mischen und mit destilliertem Wasser auf 1 L auffüllen.
Konfitüre (Zucker): 1-2 g Konfitüre in einem Erlenmeyerkolben einwiegen und 10 ml Schwefelsäure zusetzen. 20 min in einem kochenden Wasserbad erhitzen, regelmäßig rühren bis die Hydrolyse komplett ist. Die Probe abkühlen lassen und vorsichtig 12 ml Natronlauge zusetzen. Rühren, in einen 100 ml Kolben filtrieren, mit destilliertem Wasser auf 100 ml auffüllen. 10 ml davon mit einer Pipette in einen anderen 100 ml Kolben überführen und auf 100 ml auffüllen. Das ist die Testlösung. Gut rühren.
Konfitüre (reduzierende Zucker): 3,0 g Konfitüre in einen Erlenmeyerkolben füllen, 50 ml destilliertes Wasser zugeben, unter Rühren 10 min erhitzen. In eine 100 ml Flasche filtrieren und mit destilliertem Wasser auf 100 ml auffüllen. Mit einer Pipette 10 ml in eine weitere 100 ml Flasche überführen und mit destilliertem Wasser auf 100 ml auffüllen. Das ist die Testlösung. Gut rühren.
Glukosestandard (15 mg/ml): 1,5 g Glukose in einen 100 ml Kolben einwiegen und mit destilliertem Wasser auf 100 ml auffüllen. Rühren.
Erstellung der Kalibrationskurve
- Fünf 100 ml-Flaschen mit den Buchstaben A-E beschriften. In jede beschriftete Flasche die in Tabelle 1 angegebene Mengen an Glukosestandard und destilliertem Wasser hinein pipettieren.
Tabelle 1: Herstellung der Standardglukoselösung |
Volumen der Glukoselösung (ml) |
2 |
3 |
6 |
8 |
10 |
Volumen destilliertes Wasser (ml) |
98 |
97 |
94 |
92 |
90 |
Glukosekonzentration (mg/ml) |
0.3 |
0.45 |
0.9 |
1.2 |
1.5 |
Label and fill six test tubes as specified in Table 2.
Probennummer |
Blank |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
Tabelle 2: Herstellung der Lösungen für die Kalibrationskurve
Glukosestandard (Flasche) |
N/A |
A |
B |
C |
D |
E |
Volumen Glukosestandard (ml) |
0 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
Volumen DNSA-Reagens (ml) |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
Volumen destilliertes Wasser (ml) |
3 |
2 |
2 |
2 |
2 |
2 |
Abbildung 4: Die
Kalibrationslösungen
Mit freundlicher Genehmigung
von Irena Štrumbelj Drusany
- Teströhrchen mit Inhalt 5 min in kochendem Wasser erhitzen; das DNSA-Reagens reagiert mit in der Probe vorhandenen reduzierenden Zuckern zu einem rotbraunen Produkt.
- Teströhrchen abkühlen, je 6 ml destilliertes Wasser zugeben und gut schütteln.
- Messung der Lichtdurchlässigkeit jeder Lösung mit der blauen LED (430 nm) des Fotometers.
Die vom Spektra-Gerät abgelesenen Werte ist die Durchlässigkeit in Prozent. Sie müssen durch 100 dividiert werden, um die Werte für die Durchlässigkeit für die nachfolgenden Berechnungen zu erhalten. Die Durchlässigkeit (T) lässt sich nach folgender Formel in die Absorption (A) umrechnen: A = –log T. Siehe 2. und 3. Spalte in Tabelle 3.
Das Bild rechts zeigt die Kalibrationslösungen; Sogar der Blindwert (Wasser mit DNSA ohne Glukose) hat eine intensive Färbung. Es ist daher notwendig, alle Proben, auch den Blindwert, gegen destilliertes Wasser zu messen. Die durch die Glukose verursachte Absorption der Proben kann durch Subtraktion der Absorption des Blindwerts von der Absorption der Probe ermittelt werden (siehe 4. Spalte in Tabelle 3).
Glukosekonzentration (mg/ml) |
Durchlässigkeit (Messwert Spektragerät, T%) |
Absorption (A) |
lucose-specifische Absorption (A – ABlindwert) |
Table 3: Calibration curve – sample absorbance measurements of different concentrations of glucose solution
0 (Blank) |
27.54 |
0.56 |
0 |
0.3 |
23.44 |
0.63 |
0.07 |
0.45 |
20.04 |
0.69 |
0.13 |
0.9 |
18.21 |
0.74 |
0.18 |
1.2 |
15.13 |
0.82 |
0.26 |
1.5 |
14.45 |
0.84 |
0.28 |
6. Diagramm erstellen: Glukosekonzentration versus Glukose-spezifischer Absorption, siehe Abbildung 5.
Abbildung 5: Probenkalibrationskurve – X-Achse: Glukosekonzentration; Y-Achse: Glukose-spezifische Absorption
Messung der Konfitüreproben
Die Konfitürenprobe sollte genauso behandelt werden wie die für die Kalibrationskurve eingesetzten Glukosestandards.
- Für jede zu testende Konfitüre 1 ml vorbereitete Konfitürenprobe (siehe “Herstellung von Lösungen”) in ein Teströhrchen geben, 1 ml DNSA-Reagens und 2 ml destilliertes Wasser zugeben.
- Proberöhrchen mit Inhalt 5 min in kochendem Wasser erhitzen; das DNSA-Reagens reagiert mit den in der Probe vorhandenen Zuckern unter Bildung eines rotbraunen Produkts.
- Abkühlen der Teströhrchens, 6 ml destilliertes Wasser zugeben und gut schütteln.
- Messung der Durchlässigkeit (T%) jeder Koniftürenprobe mit der blauen LED (430 nm) des Photometers. Durch 100 dividieren, um T zu erhalten. Mit der Gleichung; A = –log T T in A umrechnen, diesen Wert zur Errechnung der Glukose-spezifischen Absorption heranziehen (A – ABlindwert).
Tabelle 4 zeigt ein Beispiel für ermittelte Werte für die Durchlässigkeit und die daraus errechneten Glukose-spezifische Absorption der Proben.
Probe |
Durchlässigkeit
(Messwerte des Spektra-Geräts, T%) |
Absorption
(A) |
Glukose-spezifische Absorption
(A – ABlindwert) |
1 |
18.6 |
0.73 |
0.17 |
2 |
21.3 |
0.67 |
0.11 |
- Die Absorptionsmesswerte mit Hilfe der Kalibrationskurve in Glukosekonzentrationen (mg/ml) der Probe umwandeln.
Das in Tabelle 4 verwendete Beispiel ergäbe eine abgelesene Glukosekonzentration von:
Probe 1: 0.8 mg/ml
Probe 2: 0.5 mg/ml
6. Errechnung der Masse der Glukose in 1 g Konfitüre unter Verwendung folgender Gleichung:Masse der Glukose (g pro 1 g Probe) = Massenkonzentration (mg/ml) x 10 x 100 ml
wobei
die Massenkonzentration der in der Kalibrationskurve abgelesene Wert ist
10 die Verdünnung angibt (siehe “Herstellung von Lösungen)
100 ml das Volumen, in dem 1g Konfitüre homogenisiert worden ist.
In unserem Beispiel:
Probe 1: Masse der Glukose (g pro 1g Probe) = 0,8 mg/ml x 10 x 100 ml = 0,8 g
Probe 2: Masse der Glukose (g pro 1g Probe) = 0.5 mg/ml x 10 x 100 ml = 0,5 g.
Alle Berechnungen gehen von der Annahme aus, dass 1 g Probe eingewogen worden sind. Wenn man z.B. 2g Probe einwiegt, muss man die Zahlen von oben durch 2 dividieren um die Masse der Glukose in g pro g Probe zu erhalten.