Impressão digital genética: um olhar ao seu interior Understand article

Traduzido por António Daniel Barbosa. Nas séries televisivas, a impressão digital genética é habitualmente usada para identificar criminosos. Sara Müller e Heike Göllner-Heibült espreitam os bastidores.

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A ideia de distingui os indivíduos através das suas características genéticas não é nova. Descoberto em 1900 por Karl Landsteinerw1, o tipo sanguíneo ABO foi o primeiro marcador genético a ser usado nas ciências forenses, posteriormente complementado pelo grupo sanguíneo MN (1927) e pelo fator Rhesus (1937).

Contudo, mesmo quando analisamos os três sistemas sanguíneos simultaneamente, cerca de uma em cada dez pessoas origina resultados idênticos; razão pela qual é possível realizar transfusões sanguíneas. Porém, para os objetivos das ciências forenses, esta é uma desvantagem: os resultados podem dizer que a amostra de sangue não provém do Suspeito X, mas não pode dizer com um grau de certeza aceitável que provém do suspeito Y.

Avanços foram realizados nos anos 70 e 80 com a análise de diferentes formas de enzimas (isoenzimas) nos glóbulos vermelhos e soro sanguíneo. A certeza de que uma amostra provém definitivamente do suspeito depende do número de proteínas analisadas (habitualmente quatro); esta segurança é designada por poder de discriminação. O poder de discriminação que estas técnicas combinadas ofereciam era de apenas 1:1000, melhor do que a capacidade de 1:10 da análise dos grupos sanguíneos, mas ainda não suficientemente satisfatório. Para obter uma capacidade superior, foi necessário examinar mais de perto a nossa composição genética.

A nossa composição genética – quem somos

Dos pares de bases até aos
cromossomas (não está à
escala): como o DNA é
empacotado. Clique na
imagem para ampliar

Imagem cortesia de Darryl Leja,
NHGRI / NIH

O genoma humano consiste em 46 pares de cromossomas: 23 da nossa mãe, 23 do nosso pai. Desta forma, possuímos dois de cada cromossoma (exceto – no caso dos homens – os cromossomas sexuais) e assim duas cópias de cada gene.

O principal componente dos cromossomas é o ácido desoxirribonucleico (DNA), que contem a informação para produzir as proteínas das quais necessitamos para viver. Porém, dos nossos 3 mil milhões pares de bases (pb), apenas cerca de 4% codifica efetivamente para proteínas; o resto é habitualmente apenas “enchimento” que consiste de sequências repetitivas organizadas em agregados. Se se comparar o DNA de dois seres humanos, a maioria será idêntico, com a variabilidade a ser detetada principalmente nestas sequências repetitivas.

Pessoas diferentes podem ter números diferentes de repetições destas sequências: uma pessoa pode ter cinco repetições num locus (local) de DNA específico; outra pessoa pode ter sete. Utilizando amostras, por exemplo de sangue ou sémen, pode-se analisar as sequências repetitivas em diversos loci de DNA; chama-se a esta análise uma impressão digital genética. Tal como as impressões digitais, as impressões digitais genéticas podem ser usadas para distinguir indivíduos.

Apesar do termo “impressão digital genética” (ou perfil genético) ser habitualmente usado, nem todos estão cientes de que na verdade esta corresponde a duas técnicas muito diferentes, apenas uma das quais é frequentemente usada nas ciências forenses atualmente.

Impressão digital genética inicial: polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrição

Imagem cortesia de Arno
Bachert / pixelio.de

O primeiro método de impressão digital genética foi inventado em 1984 por Alec Jeffreysw2, que usou sequências repetitivas de DNA conhecidas por repetições em série de número variável (VNTRs; por exemplo a sequência D1S80, (AGGACCACCAGGAAGG)n). Estas sequências, 10-100 pb por repetição, podem ser investigadas usando enzimas de restrição, que funcionam como tesouras moleculares que cortam o DNA em sequências definidas (sequências de reconhecimento). Em todo o nosso genoma, uma sequência de reconhecimento de 6 pb surgirá cerca de 730 000 vezes.

Isto significa que se se cortar o nosso genoma com uma enzima de restrição específica, obter-se-á cerca de 730 000 fragmentos de restrição de comprimentos variáveis. E é aqui que as VNTRs se tornam importantes: um número de repetições num agregado VNTR particular pode variar entre indivíduos, o que significa que o comprimento do fragmento de restrição correspondente irá variar também entre os indivíduos (Figura 1). Este fenómeno é designado por polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrição (RFLP).

Figura 1: Visão global de dois VNTRs de dois indivíduos distintos. Os locais cortados por enzimas de restrição (tesouras moleculares) estão indicados por uma seta. Dependendo do número de repetições VNTR, são formados fragmentos de DNA de diferentes tamanhos (ver também Figura 2, Passo 4)
Imagem cortesia de Sara Müller

Dos 730 000 fragmentos de restrição, apenas alguns irão diferir entre os indivíduos – muito poucos para serem detetados visualmente. Por isso, os cientistas usam uma técnica chamada Southern blotting que permite que apenas as sequências de interesse sejam visualizadas. Para tal, os fragmentos de restrição são separados de acordo com o seu tamanho por electroforese em gel, usando uma corrente elétrica para mover as moléculas de DNA carregadas através do gel. A distância percorrida é determinada pelo tamanho do fragmento (Figura 2, Passo 1). De seguida, o DNA é transferido para uma membrana (Figura 2, Passo 2) e uma sonda radioativa complementar ao(s) VNTR(s) de interesse é adicionada. A sonda hibridiza (liga-se) às sequências complementares (Figura 2, Passo 3) e colocando a membrana num filme de raio-X os cientistas obtêm uma imagem das bandas marcadas radioactivamente, cada qual representando um fragmento de comprimento diferente (Figura 2, Passo 4). Esta imagem é a impressão digital genética.

Então, quantos VNTRs é necessário comparar para distinguir os indivíduos com segurança? Se os cientistas escolherem VNTRs com uma variabilidade suficiente (por exemplo D1S80, que pode ser repetido entre 15 a 41 vezes), apenas necessitam de comparar quatro VNTRs diferentes para obterem um poder de discriminação de 1:1 milhão – muito melhor do que o 1:10 oferecido pelo tipo sanguíneo ABO.

Figura 2: Análise RFLP após digestão do DNA com enzimas de restrição. Clique na imagem para ampliar
1. Separação dos fragmentos de DNA digerido pelo tamanho através de electroforese. Moléculas maiores com mobilidade mais lenta no gel podem ser observadas na parte superior da imagem; moléculas mais pequenas com mobilidade no gel superior encontram-se na parte inferior
2.-3. Técnica de Southern blot. O DNA separado é transferido para uma membrana e de seguida detetado com uma sonda marcada radioactivamente contra os VNTRs A e B
4. O filme de raio-X exposto apresenta uma impressão digital genética individual para cada pessoa (comparar com a Figura 1)

Imagem cortesia de Sara Müller
Figura 3: Um diagrama
simplificado que mostra
como fragmentos definidos
de DNA são amplificados por
PCR. Clique na imagem para
ampliar

Imagem cortesia de Sara Müller

A técnica atual: Impressão digital genética por PCR

A invenção de Kary Mullis, em 1983, da reação em cadeia da polimerase (PCR) valeu-lhe o prémio Nobel da Químicaw3, w4. Esta invenção, juntamente com a descoberta nos finais da década de 80 de repetições pequenas em série (STRs) – sequências repetitivas de 2-9 pb, também designadas por microssatélites – abriu caminho para a técnica de impressão digital genética de alta velocidade que as ciências forenses utilizam atualmente.

Por PCR é possível amplificar exponencialmente um locus de DNA de interesse (por exemplo o STR de 4 pb conhecido como D18S51, (AGAA)n), produzindo milhões de cópias de uma única molécula de DNA em poucas horas (Figura 3). Para os cientistas forenses, esta técnica tem a vantagem de permitir a análise de amostras muito pequenas – bastam 30 células (ver Tabela 1 para uma comparação com a impressão digital genética por RFLP).

Na análise por PCR, precisamos de STRs flanqueadas por sequências que são idênticas em todos os seres humanos (estas sequências designam-se por conservadas). São então usados primers – pequenas moléculas que são complementares às sequências conservadas flanqueantes (genes 1134 e 1135 na Figura 4) – para iniciar o PCR. Uma vez amplificado o DNA, este pode ser separado quer por eletroforese em gel (Figura 5) ou, nas ciências forenses modernas, por sequenciação eletroforética automatizada (Figura 6), e ser visualizado como uma impressão digital genética.

Figura 4: Representação esquemática do STR D1S80 (a nomenclatura ‘D1S80’ diz-nos que o STR está no cromossoma 1, na região 80) de dois indivíduos. As setas pretas representam os primers usados para a amplificação desse STR específico. Clique na imagem para ampliar
Imagem cortesia de Sara Müller

Possuímos duas cópias de cada cromossoma, logo também temos duas cópias de cada STR. Se, para cada cópia do STR, alguém tem o mesmo número de repetições (isto é, o mesmo alelo), a análise de PCR mostra apenas um fragmento de DNA de um único tamanho: a pessoa é homozigótica para esse alelo do STR (seta verde na Figura 5, correspondente ao indivíduo 2 na Figura 4). Se os dois cromossomas possuem alelos não idênticos para esse STR, fragmentos com dois tamanhos distintos são observados e diz-se que a pessoa é heterozigótica (seta vermelha na Figura 5, correspondente ao indivíduo 1 na Figura 4).

Figura 5: Impressão digital genética do locus D1S80 obtida por estudantes do secundário (colunas numeradas de 1–16) com o seu próprio DNA. A coluna mais à direita, indicada com M, contem fragmentos de DNA de tamanhos conhecidos, usados como marcadores.
O indivíduo indicado com a seta verde é homozigótico para o locus D1S80 (é apenas visível uma banda). O indivíduo assinalado pela seta vermelha é heterozigótico (duas bandas). A seta azul indica dois alunos que são heterozigóticos e que têm o mesmo número de repetições para cada alelo no locus D1S80; tal significa que não podem ser distinguidos através de impressão digital genética. Podem ser gémeos, embora seja igualmente provável que duas pessoas sem parentesco possuam o mesmo número de repetições se apenas um STR for analisado

Imagem cortesia de Sara Müller

Se analisarmos apenas um STR, a probabilidade de duas pessoas sem parentesco terem a mesma impressão digital genética por PCR é elevada – entre 1:2 e 1:100 (setas azuis na Figura 5). Tal acontece porque os STRs têm menos alelos e menor heterozigosidade do que os VNTRs usados nas impressões digitais genéticas por RFLP. Para ultrapassar esta desvantagem, múltiplos STRs são analisados simultaneamente; com 16 STRs, como é comum nos casos tratados na Alemanha, é possível obter um poder de discriminação de 1:10 mil milhões (equivalente a uma pessoa na população mundial; Figura 6).

Figura 6: Eletroferograma de uma mulher, obtido por PCR multiplex e subsequente sequenciação eletroforética automatizada. Oito STRs (D3, TH01, D21, D18, SE33, vWA, D8 and FGA) e amelogenina (que indica o sexo) foram analisados. As linhas azuis, verde e preta representam STRs amplificados (com o número de repetições abaixo dos picos). A linha vermelha é o marcador (o tamanho do fragmento de DNA indicado em pb). Clique na imagem para ampliar
Imagem cortesia de Sara Müller
Comparação de impressão digital genetica por RFLP e PCR
Segundo Butler (2010)
  RFLP PCR

Quantidade de DNA inicial

30–50 µg

Pelo menos 200 pg (cerca de 30 células) para um padrão completo de STR

Sensibilidade

+

+++

Qualidade do DNA requerido para a análise

Genoma completo

Não é necessário o genoma completo; produtos de degradação são suficientes por implicar pequenas sequências (o comprimento total da sequência de um STR, incluindo repetições múltiplas e sequências flanqueantes, é aproximadamente de 50–500 pb)

Tempo

Dias a semanas

Horas

Poder de disciminação por locus

+++
(Mais alelos e maior heretozigosidade por locus)heterozygosity per locus)

+
(Menos alelos e menor heterozigosidade por locus)
No entanto, amplificação por PCR multiplex (PCR com mais do que um par de primers) e marcação multi-color permite que mais de 16 loci sejam examinados simultaneamente, o que fornece um excelente poder de discriminação

Unidade de repetição

10 a 100 pb

2 a 9 pb (nos casos forenses, maioritariamente 4 pb)

Deteção automática

Não é possível

Possibilidade de processamento da amostra em larga escala

Número de loci validados (importantes se familiares estiverem envolvidos)

Número limitado

Grande número

Risco de contaminação

+

+++

Medidas adicionais de segurança necessárias?

Sim (devido à marcação radioativa)

Não (não possui marcação radioativa)

Aplicações da impressão digital genética

Gêmeos idênticos terão
normalmente impressões
genéticas idênticas

Imagem cortesia de e3000;fonte
da imagem: Flickr

Sabe-se atualmente o que é a impressão digital genética, mas como usa-la? Impressões genéticas por PCR são amplamente usadas nas investigações forenses: permite à polícia excluir ou identificar suspeitos com base em material genético como folículos de cabelo, pele, sémen, saliva ou sangue (ver a história que pode ser descarregada em baixow5). No entanto, por si só, uma impressão digital genética não é uma evidência suficiente para uma acusação, uma vez que parentes próximos podem possuir impressões genéticas muito semelhantes (e gémeos monozigóticos terão normalmente impressões genéticas idênticas).

Nicolau II, o último czar da
Rússia, com a czarina
Alexandra e as suas quatro
filhas. Após a revolução
Russa, toda a família foi
assassinada em Julho de
1918. Os seus corpos,
encontrados em 1979 (o czar,
a czarina e três filhas) e em
2007 (o czarevitch e a filha
que faltava, Maria) foram
identificados por impressão
digital genética

Imagem cortesia de the
Romanov Collection, General
Collection, Beinecke Rare Book
and Manuscript Library, Yale
University

E para complicar as investigações forenses, apesar da recomendação Europeia para analisar 16 STRs, cada país pode decidir quais STRs analisar, o que torna as comparações difíceis.

O método à base de PCR é também usado nos seres humanos em testes de paternidade, diagnóstico de diversas doenças genéticas (por exemplo doença de Huntingdon), identificação de vítimas de acidentes, na elaboração de árvores genealógicas, procurar pessoas desaparecidas e investigar figuras históricas (por exemplo o último czar da Rússia e sua família). Em outros organismos pode ser usado para fins de conservação (por exemplo analisar marfim confiscado), investigações sobre droga (por exemplo na análise de plantas de canábis apreendidas), para controlar a qualidade alimentar e da água (por exemplo identificando micróbios contaminantes), na medicina (por exemplo para detetar infeções virais como o VIH, hepatite ou grite) e em investigações de bioterrorismo (por exemplo na identificação de estipes microbianas).

A impressão digital genética à base de RFLP, apesar de bastante obsoleta devido às imensas vantagens do método baseado em PCR (Tabela 1), é ainda usada na classificação de plantas e animais em investigações fundamentais.

Impressão digital genética na escola

O isolamento de DNA nas escolas dá aos alunos um momento “wow” quando se apercebem que estão a olhar para a informação genética completa que codifica para um organismo – umas poucas cadeias de DNA em forma de novelo de lã que são precipitadas com álcool. É fácil de realizar na escola usando salivaw6 (ou células epiteliais obtidas de kits comerciais), ervilhas (Madden, 2006), tomates, cebolasw7 ou timo de vitelo (verifique as restrições locais para a utilização de timo de vitelo nas escolas)w8.

A impressão digital genética
pode ser usada em trabalhos
de conservação, por exemplo
para analisar marfim
confiscado

Imagem cortesia de Ulla
Trampert / pixelio.de

Uma análise subsequente de um STR específico no DNA humano, por exemplo D1S80 ou TH01, pode ser realizada na escolaw6, utilizando kits comerciais disponíveis a um preço razoávelw9 se necessário. Se a sua escola não tiver acesso a um termociclador, o ciclo térmico pode ser realizado em três banhos de água, apesar de ser enfadonho e trabalhoso.

Se este equipamento não estiver disponível, existem kits que simulam e simplificam todo o processo de impressão digital genéticaw10. Estes kits contêm fragmentos de DNA que simulam a amplificação de diferentes alelos de um STR ou VNTR único. (De facto, são fragmentos de DNA por restrição de um plasmídeo ou de DNA de fago lamba.) O DNA requere eletroforese e subsequente coloração de forma a que os alunos sejam capazes de comparar as sequências de DNA “amplificadas” de uma amostra de uma prova com amostras de diversos suspeitos. É claro que isto é muito diferente de detetar STRs amplificados usando sequenciação eletroforética automatizada (e nem sequer representa de uma forma precisa a visualização de VNTRs usando Southern blotting, uma vez que o DNA é corado diretamente no gel), no entanto demonstra os princípios do processo analítico. Ao usar estes kits de simulação, os alunos devem ser alertados para o facto de a experiência dar a ideia que diferenças entre os indivíduos podem serem facilmente identificadas, o que não é o caso.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer a Wolfgang Nellen pelas suas ideias sobre o artigo e por permitir que as instruções da Science Bridge fossem disponibilizadas gratuitamente.

Estão também gratos a Shelley Goodman pelos seus conselhos sobre o uso de kits comerciais nas escolas.

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References

Web References

  • w1 – Em 1930, Karl Landsteiner foi galardoado com o Prémio Nobel da Fisiologia e Medicina pelas suas descobertas dos grupos sanguíneos humanos. Para saber mais, pode consultar a página da internet do Prémio Nobel (www.nobelprize.org) ou usar a ligação: http://tinyurl.com/7zjg2mw
  • w2 – Para saber mais sobre as descobertas de Alec Jeffreys, consultar: www2.le.ac.uk/departments/genetics/jeffreys
  • w3 – Em 1993 o Prémio Nobel da Química foi atribuído a Kary B Mullis pela sua invenção da reação em cadeia da polimerase (PCR). Para saber mais, consultar a página da internet do Prémio Nobel (www.nobelprize.org) ou usar a ligação: http://tinyurl.com/7fkh7ku
  • w4 – Para saber mais sobre PCR, pode visualizar este vídeo: www.youtube.com/watch?v=_YgXcJ4n-kQ
  • w5 – Uma história que ilustra como a impressão digital genética pode ser usada num caso forense pode ser descarregada aqui nos formatos Word® ou PDF.
  • w6 – Para instruções (em inglês e alemão) para a realização de uma impressão digital genética à base de PCR nas escolas, consultar a página da Internet da Science Bridge (www.sciencebridge.net) ou usar a ligação: http://tinyurl.com/89u7m53
    • Ser associado da Science Bridge é normalmente necessário para aceder a estas instruções, mas os leitores deste artigo podem requere-las gratuitamente através do correio eletrónio sara.mueller@sciencebridge.net

  • w7 – Para instruções (em alemão) sobre como isolar DNA a partir de cebolas ou tomates, consultar a página da internet da Science Bridge (www.sciencebridge.net) ou usar a ligação: http://tinyurl.com/7z56745
  • w8 – Para instruções (em alemão) sobre isolamento de DNA a partir de timo de vitelo, consultar a página da internet da Science Bridge (www.sciencebridge.net) ou usar a ligação http://tinyurl.com/6lwu83g
  • w9 – Para exemplos de kits comerciais que podem ser usados para análise por PCR na escola, consultar ‘crime scene investigator PCR basics kit’ na página da internet da Biorad (www.bio-rad.com) e os kits de PCR no website da Edvotek (www.edvotek.co.uk).
  • w10 – Para exemplos de kits comerciais para escolas que simulam e simplificam o processo de impressão digital genética, consultar ‘forensic DNA fingerprinting kit’ na página da internet da Biorad (www.bio-rad.com) e o “DNA fingerprinting by restriction fragmentation patterns kit” (nas secções “forensics” e “DNA”) na página da internet da Edvotek (www.edvotek.co.uk).

Resources

  • Para aprender mais sobre sequências de DNA repetitivas e os métodos (RFLP e PCR), consultar:
    • Klug WS, et al. (2008) Concepts of Genetics 9th edition. San Francisco, CA, USA: Pearson. ISBN: 9780321524041

  • Para descobrir mais sobre PCR e STRs, bem como bases de dados mundiais e casos forenses, consultar:
    • Goodwin W, Linacre A, Hadi S (2010) An Introduction to Forensic Genetics. Chichester, UK: Wiley-Blackwell. ISBN: 978-0470710197

  • Para um jogo de deteção de DNA na sala de aula de aula, consultar:
  • A Universidade do Arizona, Estados Unidos da América, descreve como executar uma atividade escolar sobre perfis de DNA usando STRs. Consultar: www.biology.arizona.edu ou usando a ligação: www.biology.arizona.edu ou usar a ligação: http://tinyurl.com/7zteg9n
  • A página da internet sobre a iniciativa do DNA: Desenvolvendo a Justiça Criminal através da Tecnologia do DNA oferece um curso online sobre a análise forense do DNA. Destinado a advogados, o curso e o caso de estudo que o acompanha fornecem uma excelente introdução a este assunto. Consultar: www.dna.gov/training/otc
  • Para investigar uma base de dados real de STRs, visite a página da internet do US National Institute of Standards and Technology: www.cstl.nist.gov/biotech/strbase
  • Para aprender mais sobre como as doenças genéticas são diagnosticadas, consultar:

Author(s)

Sara Müller estudou biologia, química e educação na Universidade de Kassel, Alemanha, e recebeu a sua licenciatura para lecionar em escolas secundárias em 2008. Em dezembro de 2011 terminou a sua tese de doutoramento no campo da epigenética, também na Universidade de Kassel. Desde de Fevereiro de 2012 tem executado o seu treino prático como professora em Göttingen, Alemanha. Tem sido um membro do conselho executivo da Science Bridgew6 durante os últimos sete anos.

Heike Göllner-Heibült é uma perita científica em DNA nas ciências forenses com formação em biologia molecular. Estudou biologia humana na Philipps University de Marburg, Alemanha, passando diversos meses na Erasmus University de Roterdão, Holanda, e na Universidade de Cambridge, Reino Unido. Em 2002 terminou o seu doutoramento em biologia molecular no Institute of Molecular Biology and Tumor Research em Marburg e começou a trabalhar em DNA nas ciências forenses como perita de DNA e agente de comunicação. Trabalha atualmente para o Forensic Science Institute da agência de investigação criminal em Berlim, Alemanha.


Review

A ideia de usar o DNA para identificar um indivíduo é alucinante. A impressão digital genética de um indivíduo assenta nas sequências não codificantes, mas como são estas impressões genéticas criadas? Este artigo explica.
A capacidade de identificar criminosos a partir de bases de dados levanta questões importantes: será ético manter DNA humano em tais bases de dados ou será um violação dos direitos humanos? Deverá existir uma impressão digital genética de cada pessoa ou só dos que forem detidos? Durante quanto tempo deve ser mantido o perfil de DNA?

Os alunos poderão querer discutir como a impressão digital genética pode ajudar a diagnosticar doenças genéticas, bem como as suas aplicações na luta contra a caça furtiva e a extinção de espécies. Idealmente deverão ser capazes de testar a técnica por eles mesmos, quer numa experiência real ou simulada.


Shelley Goodman, Reino Unido




License

CC-BY-NC-ND