Traduit par C. Pugieux

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Fred Engelbrecht et Thomas Wendt du Laboratoire d’Enseignement ExploHeidelberg (Heidelberg, Allemagne) décrivent des expériences de détection du sucre afin de sensibiliser le public aux problèmes auxquels sont confrontés les diabétiques au quotidien.

Le diabète, une maladie de la civilisation moderne

Le monosaccharide glucose est la source d’énergie principale de l’organisme vivant eucaryotique et les cellules l’utilisent pour la respiration aérobie ou anaérobie. Il sert aussi de précurseur à la production de protéines et au métabolisme des lipides. C’est donc une molécule clef dans plusieurs processus métaboliques et sa concentration dans le sang doit être régulée de manière précise par l’insuline et le glucagon.

Le diabète mellitus (ou tout simplement diabète) est un syndrome caractérisé par un dysfonctionnement du métabolisme du glucose et par des taux de sucre très élevés dans le sang (hyperglycémie). Cela est dû soit à un taux insuffisant de l’hormone appelée insuline ou à une résistance anormale à l’effet de l’insuline en plus de niveaux de sécrétion de l’insuline insuffisants pour compenser cette résistance.

Il y a deux formes principales de diabète : le type 1 et le type 2. Bien qu’ils aient des causes différentes, les malades sont incapables dans les deux cas de produire suffisamment d’insuline dans les cellules beta du pancréas afin de prévenir l’hyperglycémie.

Le diabète de type 1 compte pour environ 10% des cas de diabète en Europe, et est caractérisé par la perte des cellules beta du pancréas, généralement par défense auto-immunitaire. Comme il touche souvent des patients jeunes, on l’appelle aussi diabète juvénile. C’est la forme la plus sévère de la maladie car il n’existe aucun traitement. La seule solution pour les patients est de modifier leur mode de vie, par exemple en améliorant leur alimentation, en pratiquant régulièrement de l’exercice et en contrôlant leurs taux de sucre sanguin. De plus, des injections sous-cutanées ou par dispense continue d’insuline dans le sang à l’aide d’une pompe sont nécessaires afin d’éviter le coma ou la mort.

Le diabète de type 2 est dû à la résistance de l’organisme à l’insuline ou à une sensibilité réduite des tissus cibles, en plus d’une sécrétion d’insuline insuffisante. La réponse réduite des tissus du corps à l’insuline est certainement liées aux récepteurs à insuline des membranes cellulaires. Par conséquence, le corps nécessite de plus grandes quantités d’insuline pour maintenir des taux de sucre sanguins normaux. Le diabète se développe dès lors que les cellules beta du pancréas n’arrivent plus à faire face à cette demande. Le diabète de type 2, communément appelé diabète de l’adulte, apparaît généralement après l’âge de 30 ans. Dans la plupart des cas, il est lié à l’obésité et à un manque d’activité physique. Un changement pour un mode de vie plus sain peut améliorer cette condition voire même la curer. Voir Dugi (2006) pour plus de détails sur le diabète.

Les personnes affectées par le diabète ont besoin d’apprendre à vivre avec les symptômes de la maladie. Cela inclut une miction fréquente, une soif intensifiée et par conséquence une consommation augmentée de fluide. Sachant qu’un nombre important d’enfants est touché par le diabète, il est essentiel de sensibiliser les élèves à la maladie dès le plus jeune âge. Les patients souffrant de diabète ont besoin d’apprendre à minimiser leurs symptômes ou même à prévenir la maladie en ayant une alimentation saine et équilibrée et en pratiquant suffisamment d’exercice. Les élèves en bonne santé devraient être sensibilisés aux besoins de leurs camarades affectés par la maladie.

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C’est dans cette optique que nous avons rassemblé des expériences pour permettre aux élèves de détecter les glucides. Une série d’expériences permet de détecter si une solution contient, ou non, de l’amidon, des protéines, ou des sucres tels que le glucose, le lactose ou le saccharose. Une fois les sucres identifiés, des expériences complémentaires permettent de déterminer, à l’aide d’une réaction enzymatique, quels échantillons contiennent du lactose ou du glucose. Le principe de ces expériences est le même que celui permettant de déterminer le taux sanguin de glucose pour le diagnostic du diabète, ou pour mesurer le taux de glucose et/ou lactose, par exemple dans les jus de fruits, le lait ou les produits laitiers. Ces expériences, par conséquent, donnent aux élèves une idée sur la manière dont les diabétiques peuvent suivre leurs taux de sucre.

Expérience 1: Détection du sucre, de l’amidon et des protéines

Les étudiants reçoivent cinq échantillons, étiquetés de A à E, contenant de l’amidon, une protéine (albumine de sérum bovin), du glucose monosaccharide ou des di-saccharides (lactose ou saccharose). Toutes les solutions ont une concentration de 0,1% dans l’eau. Vous pourriez également évaluer des échantillons de boisson énergétiques contenant du glucose incolore (par exemple Powerade®-citron). En utilisant différents réactifs, les étudiants devraient déterminer lequel des cinq échantillons contiennent du sucre, de l’amidon ou des protéines.

Pour une classe de 30 élèves, travaillant en binôme, vous aurez besoin des solutions suivantes:

• Une solution de Fehling fraîchement préparée, obtenue en mélangeant des volumes égaux de solution de Fehling I bleue claire (7 g CuSO₄·5H₂O dissous dans 100 ml d’eau distillée) et de solution de Fehling II incolore (35 g C₄H₄KNaO₆ ·4H₂O et 10 g NaOH dissous dans 100 ml d’eau distillée). La solution doit être mélangée avant d’être utilisée.


• Une solution de Lugol, obtenue en dissolvant 1g d’iodine (I₂) et 2g d’iodine de potassium (KI) dans 50 ml d’eau distillée.


• Le pigment Brillant Blue de Coomassie pour l’analyse de Bradford est disponible commercialement, par exemple chez Biorad^w1.

a) Détection d’un sucre réducteur (réaction de Fehling)

1. Pipetter 1 ml de chacune des solutions étiquetées de A à E et les transférer dans 5 tubes à essai et chauffer les tubes à 60 °C dans un bain-marie pendant 2 min.
2. Ajouter 16 μl de la solution de Fehling bleue marine préparée fraîche dans chaque tube à essai et incuber à 60 °C pendant 10 min ou jusqu’à ce que la réaction colorée soit observée et qu’un précipité se forme.

Les solutions qui contiennent des sucres réducteurs tels que le fructose, le glucose ou le lactose devraient devenir rouge et développer un précipité rouge (les ions cuivre (II) dissous sont réduits en oxyde de cuivre (I) insoluble), alors qu’il ne devrait pas y avoir de changement de couleur avec le sucre ou l’amidon. La solution contenant les protéines devrait prendre une couleur violet pale.

b) Détection de l’amidon (solution de Lugol)

1. Pipetter 500 μl de chacune des solutions étiquetées de A à E et les transférer dans 5 nouveaux tubes à essai.
2. Ajouter 50 μl de solution de Lugol dans chaque tube et observer la réaction colorée.

La solution de Lugol est un indicateur de la présence d’amidon. Le pigment va colorer l’amidon en interagissant avec la structure en rouleau du polysaccharide, donnant lieu à une couleur bleue intense. Elle ne réagira pas avec les monosaccharides (glucose) ou les disaccharides (lactose ou saccharose).

c) Détection de protéines

Le dosage de protéines est basé sur la méthode de Bradford qui permet de mesurer la variation de couleur du pigment Brilliant Blue de Coomassie lorsqu’il s’attache aux protéines.

1. Pipetter 20 μl de chacune des solutions étiquetées de A à E et les transférer dans cinq nouveaux tubes à essai, puis ajouter 800 μl d’eau distillée et 200 μl de pigment de Brilliant Blue de Coomassie (réactif de Bradford).
2. Mélanger, laisser les réactions pendant 5 min puis observer la couleur des réactions.

En présence de la protéine, la solution va devenir bleue (ce changement peut être mesuré à l’aide d’un photomètre à 595nm). Les échantillons contenant le sucre ou l’amidon ne changeront pas de couleur.

Note de sécurité : la solution utilisée pour le dosage protéique de Bradford contient du méthanol et de l’acide phosphorique et doit, par conséquent, être utilisée avec précaution.

Résultats et interprétation

La solution B donne une réaction positive avec la solution de Lugol, signifiant qu’elle contient de l’amidon. La solution D donne un résultat positif avec la méthode de Bradford, révélant être une solution protéique. Les solutions A et C donnent un précipité rouge durant la réaction de Fehling et peuvent donc être identifiées comme étant les échantillons contenant les sucres réducteurs de glucose et lactose (bien qu’à ce stade il n’est pas possible de les différencier). La solution restante, E, ne montre aucune réaction aux tests et doit par conséquent être la solution de saccharose.

Expérience 2: Détermination enzymatique du sucre

Dans cette deuxième expérience, les deux solutions restantes, A et C sont testées à nouveau, afin de déterminer laquelle contient du lactose et laquelle contient du glucose. Pour cette expérience, nous utilisons le kit ‘EnzyPlus EZS 962+ lactose/D-glucose’ disponible commercialement chez BioControl^w2. Le protocole est similaire à celui utilisé en routine par les diabétiques pour évaluer leur taux de glucose sanguin. Le protocole standard du kit a été modifié et adapté à de plus petites quantités, afin qu’un plus grand nombre de tests puisse être réalisé avec les réactifs fournis. Un kit contient donc suffisamment de matériel pour 20 binômes.

Le principe du test est le suivant (voir les figures ci-dessous).

• Le disaccharide lactose est hydrolysé par l’enzyme β-galactosidase en D-galactose et D-glucose (Etape 1 below).


• En présence d’ATP, le D-glucose est phosphorylé par l’hexokinase de manière spécifique en glucose-6-phospate:  simultanément, de l’adenosine-5’-diphosphate (ADP) est formé (Etape 2).


• Le glucose-6-phosphate est oxydé par la glucose 6-phosphate dehydrogenase en gluconate-6-phosphate.


• Pendant la réaction, le NADP⁺ est réduit en NADPH. La quantité de NADPH formée au cours de la réaction est stoichiométrique à la quantité de lactose et peut être mesurée de manière photométrique par l’augmentation de l’absorbance à 340nm.

Text

Pour réaliser la réaction:

1. Prendre quatre tubes à essai de 1.5 ml et les étiqueter A+, A-, C+ et C-. Mettre 100 µl de tampon de réaction R4b (tampon phosphate pH 6.6) dans chaque tube, puis ajouter 5 µl de solution de b-galactosidase R4a dans les tubes A+ et C+ (mais pas dans les tubes A- or C-).
2. Ajouter 100 µl de la solution A dans les tubes A+ et A- et 100 µl de la solution C dans les tubes C+ et C-.

Note : Dans les étapes suivantes de cette expérience, les quatre échantillons sont traités de la même manière.

1. Laisser tous les échantillons pendant 30 min à 37 °C dans un bain-marie pendant que l’hydrolyse du lactose se produit.
2. Après l’incubation, ajouter 1 ml d’eau distillée, 200 µl de tampon de réaction R1 et 50 µl de solution R2 (qui contiennent respectivement de l’ATP et du NADP) dans chacun des quatre tubes à essai et mélanger.
3. Transférer 1 ml de chaque réaction dans des cuvettes à photométrie et mesurer la densité optique à 340 nm (OD340) après 2 min.
4. Dans chaque cuvette, ajouter 7 µl de mélange d’enzymes R3 qui contient de l’hexokinase et de la glucose-6-phosphate dehydrogenase, incuber 5 min supplémentaire et mesurer à nouveau l’absorption à 340 nm.

Résultats et interprétation

Les quatre échantillons devraient donner des valeurs d’absorption faibles à la première lecture, indiquant une absence de NADPH. La deuxième lecture (après l’ajout des enzymes) devraient permettre de distinguer les solutions A et C. Puisque la solution A donne des résultats positifs indépendemment de l’ajout ou non de b-galactosidase, on peut conclure qu’elle contient du glucose. Par contre, un changement de l’absorption de la solution C devrait uniquement être mesuré en présence de b-galactosidase (C+), indiquant qu’elle contient du lactose.

Durant ces travaux pratiques, les participants obtiennent les informations fondamentales sur le diabète et les problèmes auxquels font face les diabétiques. Pour suivre leurs taux de glucose sanguin, les malades utilisent un système de suivis en bandelette qui agit comme une boite noire mais qui est basé sur le principe utilisé dans l’experience 2. Réaliser de tels tests peut permettre la prise de conscience face au diabète et de la manière dont la maladie peut être vaincue ou évitée à travers des modifications de style de vie.

Les expériences décrites ici peuvent être réalisées en toute sécurité dans des laboratoires d’école, puisque les solutions ne présentent pas de danger selon les Régulations des Matières Dangereuses (Régulations européennes 67/548/EEC). Le niveau d’azide de sodium, utilisé comme conservateur des solutions, est en-dessous du niveau le plus bas de toxicité d’une préparation, selon la directive 1999/45/EC.

Références

Dugi K (2006) Diabetes mellitus. Science in School 1: 61-65. www.scienceinschool.org/2006/issue1/diabetes

Références Web

w1 – Biorad: www.bio-rad.com

w2 – BioControl: www.rapidmethods.com

w3 – ExploHeidelberg: www.explo-heidelberg.de

w4 – Université de l’Education de Heidelberg: www.ph-heidelberg.de