Übersetzt von Jakob Suckale

Mit freundlicher Genehmigung von iStockphoto

Fred Engelbrecht und Thomas Wendt vom ExploHeidelberg Lehrlabor beschreiben einige Experimente zum Zuckernachweis und veranschaulichen die Probleme mit denen Diabetiker jeden Tag umgehen müssen.

Zuckerkrankheit, eine moderne Zivilisationskrankheit

Der Einfachzucker Glukose ist die wichtigste Energiequelle in lebenden eukaryotischen Organismen und wird von Zellen in aerober und anaerober Atmung verwendet. Es dient ebenfalls als Ausgangsstoff für die Protein- und Lipidsynthese. Deshalb ist es ein zentrales Molekül in zahlreichen Stoffwechselwegen und seine Konzentration im Blut muss durch Insulin und Glucagon streng reguliert werden.

Diabetes mellitus (oder einfach Diabetes bzw. Zuckerkrankheit) ist ein Syndrom, gekennzeichnet durch fehlgesteuerten Zuckerstoffwechsel und überhöhten Blutzucker (Hyperglykämie). Dies entsteht entweder durch zu geringe Insulin-Konzentration oder durch eine anormale Unempfindlichkeit gegenüber dem Hormon gekoppelt mit zu geringen Insulinmengen um die Unempfindlichkeit zu überkommen.

Es gibt zwei Hauptformen der Zuckerkrankheit: Typ 1 und 2. Obwohl sie unterschiedliche Ursachen haben, sind Patienten beider Formen unfähig in den Betazellen ihrer Bauchspeicheldrüse genug Insulin zu produzieren um Überzuckerung zu vermeiden.

Zirka 10% aller Diabetes fälle in Europa sind Typ 1. Sie zeichnen sich durch den Verlust von Betazellen in der Bauchspeicheldrüse, meist durch Autoimmunzerstörung, aus. Da Typ 1 Diabetes Patienten meist im jungen Alter befällt, wird er auch juveniler Diabetes genannt. Es ist die schwerwiegendere Form der Krankheit, weil es keine Heilung gibt. Statt dessen müssen Patienten ihren Lebensstil anpassen, z.B. mit verbesserter Ernährung, regelmäßigem Sport und Messung des Blutzuckers. Außerdem ist subkutane Injektion oder kontinuierliche Verabreichung von Insulin mittels einer Pumpe nötig um Koma oder Tod zu vermeiden.

Type 2 Diabetes entsteht wegen Insulinresistenz oder verringerter Insulinempfindlichkeit der Zielgewebe zusammen mit ungenügender Insulinsekretion. Die verringerte Reaktion von Körpergeweben auf Insulin ist mit sehr großer Wahrscheinlichkeit auf Insulinrezeptoren in der Zellmembran zurückzuführen. Das führt dazu, dass der Körper ungewöhnlich viel Insulin benötigt, um ein normales Blutzuckerniveau einzustellen. Wenn Betazellen die Nachfrage nicht mehr befriedigen können, entsteht Diabetes. Typ 2 Diabetes, auch bekannt als Altersdiabetes, manifestiert sich in der Regel über 30. In den meisten Fällen, ist es verbunden mit Fettleibigkeit und zu wenig physischer Betätigung. Ein Wechsel zu einem gesunderen Lebensstil kann oft die Krankheit mildern oder sogar heilen. Siehe Dugi (2006) für mehr Details zu Diabetes.

Betroffene beider Diabetestypen müssen lernen mit den Symptomen zu leben. Diese beinhalten versträrkter Harndrang sowie Drust und deshalb auch erhöhte Flüssigkeitsaufnahme. Da viele Kinder von der Krankheit betroffen sind, ist es wichtig Schüler schon früh über die Krankheit aufzuklären. Zuckerkranke müssen lernen durch gesunde Ernährung und Sport Symptome zu minimieren oder sogar zu verhindern. Gesunde Kinder sollten die Bedürfnisse ihrer betroffenen Freunde verstehen lernen.

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Aus diesen Gründen haben wir Experimente zusammen gestellt, die Schüler befähigen Kohlenhydrate zu identifizieren. Eine Serie von Experimenten bestimmt, ob eine Lösung Stärke, Proteine oder Zucker wie Glukose, Laktose oder Saccharose enthält. Nach der Detektion von Zuckern, lässt sich mit weiteren Experimenten bestimmen, welche Proben Laktose oder Glukose enthalten. Das Prinzip dieser Versuche ist dasselbe wie in den Tests zur Blutzuckerbestimmung für die Diagnose von Diabetes oder die Glukose/Laktose-Konzentrationsmessung z.B. in Früchten, Säften, Milch- und dessen Produkten. Diese Experimente geben Schülern einen Eindruck davon wie Diabetiker ihren Zuckerstatus feststellen können.

Experiment 1: Erkennung von Zucker, Stärke und Proteinen

Schüler erhalten fünf Proben, beschriftet A bis E, welche Stärke, Protein (Rinderserum-Albumin; BSA), das Monosaccharid Glukose oder eines der Disaccharide Lactose oder Saccharose enthalten. Alle Proben sind 0,1 prozentige, wässrige Lösungen. Sie können auch farblose Energy Drinks wie Powerade^®-Lemon analysieren. Mittels verschiedenen Reagenzien bestimmen Schüler, welche der fünf Proben Zucker, Stärke oder Proteine enthält.

Für eine Klasse von 30, in Paaren arbeitenden Schülern, benötigen Sie die folgenden Lösungen:

• Frische Fehlingsche Lösung, hergestellt aus gleichen Volumina von hellblauer Fehlingscher Lösung I (7 g CuSO₄·5H₂O gelöst in 100 ml destilliertem Wasser) und farbloser Fehlingscher Lösung II (35 g C₄H₄KNaO₆·4H₂O and 10 g NaOH gelöst in 100 ml distilliertem Wasser). Die Lösung sollte erst kurz vor der Benutzung angemischt werden.


• Lugolsche Lösung, hergestellt aus 1 g Jod (I₂) und 2 g Kaliumiodid (KI) in 50 ml destilliertem Wasser.


• Coomassie Brilliant Blue Farbstoff für die Bradfordsche Probe ist kommerziell erhältlich, z.B. von Biorad^w1.

a) Nachweis eines reduzierenden Zuckers (Fehlingsche Reaktion)

1. Pipettiere je 1 ml der Proben A-E in fünf verschiedene Reaktionsgefäße und erhitze den Inhalt für 2 Min auf 60 °C in einem Wasserbad.
2. Füge 16 µl frische, tiefblaue Fehlingsche Lösung zu jedem Reaktionsgefäß hinzu und inkubiere die Gefäße bei 60°C für 10 Min oder bis die Farbreaktion und Ausfällung zu beobachten ist.

Lösungen, die einen reduzierenden Zucker wie Fruktose, Glukose oder Laktose enthalten, sollten sich rot färben und ein rotes Präzipitat bilden (lösliche Kupfer II Ionen werden reduziert zu unlöslichen Kupfer I Oxid). Keine Färbung sollte in Saccharose- und Stärkelösungen entstehen. Die Proteinlösung sollte sich schwach violett färben.

b) Stärkenachweis (Lugolsche Lösung)

1. Pipettiere je 500 µl der Lösungen A-E in fünf neue Reaktionsgefäße.
2. Füge 50 µl Lugolsche Lösung zu jedem Gefäß hinzu und beobachte die Farbreaktion.

Lugolsche Lösung ist ein Indikator für Stärke. Der Farbstoff färbt Stärke dunkelblau, indem er sich in die helikale Struktur des Polysaccharids einlagert. Er reagiert nicht mit Monosacchariden (Glukose) oder Disacchariden (Laktose und Saccharose).

c) Proteinnachweis

Der Proteinnachweis basiert auf der Bradford-Farbstoff Bindungsmethode und misst die Farbveränderung von Coomassie Brilliant Blue bei seiner Bindung an Proteine.

1. Pipettiere je 20 µl der Probe A-E in fünf neue Reaktionsgefäße und füge dann 800µl deionisiertes Wasser und 200 µl Coomassie Brilliant Blue Farbstoff (Bradford Reagenz) hinzu.
2. Mische die Bestandteile, warte 5 Min und beobachte die Farbreaktion.

In Gegenwart von Proteinen färbt sich die Lösung blau (meßbar mit einen Fotometer bei 595 nm). Die Proben mit Zucker und Stärke werden ihre Farbe nicht verändern.

Sicherheitshinweis: Der Biorad Proteinnachweis enthält Methanol und Phosphorsäure und sollte deshalb mit Vorsicht benutzt werden.

Ergebnisse und Interpretation

Lösung B reagiert mit Lugolscher Lösung und zeigt so, dass sie Stärke enthält. Lösung D gibt ein positives Ergebnis mit dem Bradford-Test und ist deshalb eine Proteinlösung. In Lösung A-C entsteht eine rote Fällung durch die Fehlingsche Reaktion und die Proben können daher als Lösungen der reduzierenden Zucker Glukose und Laktose identifiziert werden, obwohl es zu diesem Zeitpunkt nicht möglich ist zu bestimmen welcher der beiden. Die verbleibende Lösung E reagiert bei keinem der Tests und muss deshalb die Saccharoselösung sein.

Experiment 2: Enzymatische Bestimmung von Zucker

In diesem zweiten Experiment werden die beiden verbleibenden Lösungen A und C erneut getestet, um festzustellen welche Laktose bzw. Glukose enthält. Für dieses Experiment verwenden wir das kommerzielle Kit EnzyPlus EZS 962+ lactose/D-glucose, vertrieben durch BioControl^w2. Die Prozedur ist ähnlich der Methode, die von Diabetespatienten zur routinemäßigen Blutzuckermessung verwendet wird. Das Standardprotokoll des Produktes wurde modifiziert und verkleinert, um mehr Versuche mit den vorhandenen Reagenzien durchführen zu können. Ein Kit enthält genug Material für 20 Schülerpaare.

Das Prinzip des Tests ist wie folgt (siehe Abbildungen unten):

• Das Disaccharid Laktose wird durch β-Galaktosidase zu D-Galaktose und D-Glukose hydrolisiert (Schritt 1 unten).


• In der Gegenwart von ATP wird D-Glukose durch Hexokinase spezifisch zu Glukose-6-Phosphate phosphoryliert. Gleichzeitig wird Adenosin-5'-Phosphate (ADP) gebildet (Schritt 2).


• Glukose-6-Phosphat wird durch Glukose-6-Phosphat Dehyrogenase zu Gluconat-6-Phosphat oxidiert.


• Während der Reaktion wird NADP⁺ zu NADPH reduziert. Die Menge des durch diese Reaktion gebildeten NADPH ist stöchiometrisch zur Menge der Laktose und kann fotometrisch durch die Zunahme der Absorption bei 340 nm gemessen werden.

Schritt 2: Nachweis von Glukose
Mit freundlicher Genehmigung von Thomas Wendt

Zur Durchführung der Reaktion:

1. Nimm vier 1,5ml Reaktionsgefäße und beschrifte sie A+, A-, C+ und C-. Gebe 100 µl R4b Lösung (Phosphatpuffer pH 6,6) in jedes Gefäß und 5 µl β-Galaktosidase-Lösung R4a in die Röhrchen A+ und C+, jedoch nicht in die Röhrchen A- und C-.
2. Gebe 100 µl Lösung A zu den Gefäßen A+ und A- und 100 µl Lösung C in die Gefäße C+ und C-.

Hinweis: In den folgenden Schritten des Experiments werden alle vier Proben gleich behandelt.

3. Wärme alle Proben für 30 Min. bei 37 °C in einem Wasserbad während die Hydrolyse der Laktose stattfindet.
4. Nach der Inkubation füge 1ml destilliertes Wasser, 200 µl Reaktionspuffer R1 und 50 µl Reagenz R2 zu allen Proben hinzu und mische gut. (R1 enthält ATP und R2 enthält NADP).
5. Transferiere 1 ml jeder Reaktion in unterschiedliche Fotometer-Küvetten und bestimme die optische Dichte bei 340 nm (OD₃₄₀) nach 2 Min.
6. Gebe 7 µl Enzymmischung R3, welche die Hexokinase und die Glukose-6-Phosphate-Dehydrogenase enthält, zu jeder Küvette und inkubiere für weitere 5 Min. Messe die Absorption bei 340 nm erneut.

Ergebnisse und Interpretation

Alle vier Proben sollten bei der ersten Messung nur geringfügig absorbieren, was die Abwesenheit von NADPH anzeigt. Die zweite Messung nach der Zugabe des Enzyms sollte die Unterscheidung von Lösung A und C ermöglichen. Da Lösung A ein positives Ergebnis mit oder ohne β-Galaktosidase ergibt, kann gefolgert werden, dass es sich um Glukose handelt. Im Gegensatz dazu sollte eine Absorptionsveränderung bei Lösung C nur nach der Zugabe von β-Galaktosidase gemessen werden, was ein Zeichen für Laktose ist.

Während des Praktikums erhalten die Teilnehmer Informationen zu Diabetes und den Problemen mit denen sich Diabetespatienten auseinandersetzen müssen. Um ihre Blutzuckerwerte zu bestimmen, benutzen Patienten ein Teststreifen-System, das wie eine Black Box funktioniert aber auf dem Prinzip von Experiment 2 basiert. Die Durchführung solcher Experimente erhöht möglicher Weise das Bewusstsein für Diabetes und wie die Krankheit durch Veränderung des Lebensstils verhindert oder überlebt werden kann.

Die hier beschriebenen Experimente können sicher in normalen Schullaboratorien durchgeführt werden, da die verwendeten Stoffe nicht schädlich im Sinne der Gefahrstoffkennzeichnung (EG Bestimmung 67/548/EEC) sind. Die Konzentration des Konservierungsmittels Natriumazid liegt unter den niedrigsten Werten für Toxizität nach der Direktive 1999/45/EC.

Referenzen

Dugi K (2006) Diabetes mellitus. Science in School 1: 61-65. www.scienceinschool.org/2006/issue1/diabetes/german

Internet-Referenzen

w1 – Biorad: www.bio-rad.com

w2 – BioControl: www.rapidmethods.com

w3 – ExploHeidelberg: www.explo-heidelberg.de

w4 – Pädagogischen Hochschule Heidelberg: www.ph-heidelberg.de