Ψαρεύοντας γονίδια: Οι μικροσυστοιχίες DNA στην τάξη Teach article

Μετάφραση: Αναστάσιος Κουτσός (Anastasios Koutsos). Ο Αναστάσιος Κουτσός, η Alexandra Manaia και η Julia Willingale-Theune φέρνουν μια εκλεπτυσμένη τεχνική μοριακής βιολογίας στην τάξη.

Ψαρεύοντας γονίδια βήμα προς βήμα: μια μικρή ιστορία

Μια φορά και έναν καιρό ήταν ένας ψαράς σε ένα μικρό χωρίο. Κάθε μέρα ξυπνούσε και πήγαινε σε μια λίμνη για να ψαρέψει το βραδυνό του. Μια φορά έπιασε ένα λυκόψαρο, μια άλλη ένα χέλι – μερικές φορές έπιανε διαφορετικό ψάρι κάθε μέρα. Μια μέρα, αναρωτήθηκε πόσα διαφορετικά είδη ψαριών να υπήρχαν στη λίμνη και, συγκεκριμένα πόσα ψάρια να υπήρχαν από κάθε είδος. Πώς μπορούσε να το βρεί αυτό; Ήταν φανερό ότι δεν θα μπορούσε να το καταφέρει με το να πιάνει μόνο ένα ψαρι κάθε φορά – η λίμνη μπορεί να περιείχε χιλιάδες ψάρια. Έτσι, επισκέφθηκε το διαδίκτυο και βρήκε ένα βιλίο που περιείχε 20 000 διαφορετικά είδη ψαριών γλυκού νερού, όπως και το δόλωμα που χρειάζεται κανείς για να πιάσει το καθένα από αυτά.

Τελικά, σκέφτηκε μια πολύπλοκη αλλά έξυπνη λύση: τοποθέτησε 20 000 διαφορετικές πετονιές, κάθε μια με πολλά αγκίστρια, μέσα στη λίμνη. Χρησιμοποιώντας την πληροφορία από το βιβλίο του, τοποθέτησε ένα συγκεκριμένο είδος δολώματος στα αγκίστρια της κάθε πετονιά για να προσελκύσει ένα συγκεκριμένο είδος ψαριού. Τα υπόλοιπα ήταν παιχνιδάκι: περίμενε λίγο ώστε τα ψάρια να βρούν το δόλωμά τους και μάζεψε την ψαριά του.

[Σημείωση: Η ιστορία είναι φανταστική: μέχρι σήμερα μόνο 9000 είδη γλυκού είναι γνωστά και δεν υπάρχει διαφορετικό δόλωμα για αυτά].

Παρακολουθώντας τη γονιδιακή έκφραση: η αναλυτική ισχύς των μικροσυστοιχιών DNA

Γυαλιά μικροσυστοιχιών

Τώρα που η πρόχειρη ακουλουθία του γονιδιώματος έχει δημοσιευτεί (παράλληλα με αυτήν πολλών άλλων οργανισμών), η πρόκληση για τους επιστήμονες είναι να βρουν τι κάνουν τα γονίδια, και για να το κάνουν αυτό έχουν σχεδιάσει εκλεπτυσμένα εργαλεία. Ένα από αυτά είναι οι μικροσυστοιχίες DNA.

Μπορεί η ιστορία με τον ψαρά να είναι φανταστική, αλλά η βασική αρχή στην οποία στηρίχθηκε ο ψαράς για να βρεί πόσα ψάρια υπήρχαν μέσα στην λίμνη είναι η ίδια με τη βασική αρχή της τεχνολογίας μικροσυστοιχιών DNA· μιας τεχνολογίας που δημιούργησε επανάσταση στον τρόπο που οι επιστήμονες παρατηρούν τις ζωντανές διαδικασίες.

Μέχρι το 1990, οι βιολόγοι μπορούσαν να μετρήσουν ταυτόχρονα τη δραστηριότητα μόνο λίγων γονιδίων μέσα στο ίδιο κύτταρο. Ένα γονίδιο είναι ενεργό όταν μεταγράφεται στο αγγελιοφόρο μόριό του, το mRNA, το οποίο στη σειρά του χρησιμοποιείται για να φτιάξει μια ή πολλές πρωτεΐνες.

Εκτύπωση μιας
μικροσυστοιχίας

Χορηγία εικόνας από EMBL
Photolab

Ενοχλημένοι που δεν μπορούσαν να παρακολουθήσουν την ταυτόχρονη γονιδιακή έκφραση όλων των γονιδίων σε ένα κύτταρο, έψαξαν για τρόπους να μπορέσουν να το κάνουν αυτό. Για να το επιτύχουν, έπρεπε να βρουν πόσα διαφορετικά είδη mRNA υπήρχαν στο κύτταρο μια δεδομένη στιγμή και σε ποιά γονίδια αντιστοιχούσαν αυτα τα μόρια mRNA. Ήταν αυτή η επαναστατική ιδέα που κατέληξε στη δημιουργία των μικροσυστοιχιών DNA. Οι επιστήμονες δημιούργησαν κάτι παρόμοιο με τις 20 000 πετονιές της ιστορίας μας.

Πήραν ένα κομμάτι από επεξεργασμένο γυαλί, παρόμοιο με αυτό που χρησιμοποιούμε στα μικροσκόπια, και ακινητοποίησαν κομμάτια DNA στην επιφάνειά του, όπου κάθε κομμάτι αντιστοιχούσε σε ένα γονίδιο. Αυτές οι αλληλουχίες DNA μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν σα δόλωμα για να προσελκύσουν τα αντίστοιχα μόρια mRNA ενός γονιδίου, όπως το συγκεκριμένο δόλωμα προσέλκυσε ένα συγκεκριμένο είδος ψαριού. Όταν κοιταχτούν με το μάτι, αυτές οι αλληλουχίες DNA φαίνονται σαν μικρές κουκίδες. Σε κάθε κομμάτι γυαλιού εκτυπώνονται χιλιάδες κουκίδες σε παράταξη, δημιουργώντας μια μικροσυστοιχία DNA.

Τα πειράματα μικροσυστοιχιών διαρκούν αρκετό χρόνο. Οι ερευνητές πρέπει πρώτα να δημιουργήσουν τα γυαλιά και μετά να αναλύσουν την πληροφορία από χιλιάδες κουκίδες. Η αναλύση απαιτεί γνώση μαθηματικών και πολύπλοκων στατιστικών και μπορεί να πάρει μήνες. Ο μόνος τρόπος για να δείξουμε αυτές τις διαδικασίες στην τάξη είναι με εικονικά πειράματα.

Η πραγματική και εικονική μικροσυστοιχία βήμα προς βήμα

Χορηγία εικόνας από EMBL
Photolab

Η εικονική μικροσυστοιχία w1, που δημιουργήθηκε από το Ευρωπαϊκό Εργαστήριο Εκμάθησης για τις Βιοεπιστήμες (ELLS)w2 στο Ευρωπαϊκό Εργαστήριο Μοριακής Βιολογίαςw3, είναι μια εκπαιδευτική δραστηριότητα που χρησιμοποιεί απλά υλικά για να προσομοιώσει την επιστημονική διαδικασία των πειραμάτων με μικροσυστοιχίες και την ανάλυση των αποτελεσμάτων. Η δραστηριότητα είναι κατάλληλη για μαθητές 16 έως 18 ετών και μπορεί να συμπληρώσει μαθήματα γενετικής, κυτταρικής ανάπτυξης και γενετικών ασθενειών.

Ο ακόλουθος οδηγός βήμα-προς-βήμα περιγράφει τα βήματα ενός αληθινού πειράματος μικροσυστοιχίας και ενός πειράματος εικονικής μικροσυστοιχίας. Στη δραστηριότητα αυτή, η εικονική μικροσυστοιχία μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση διαφορών στη γονιδιακή έκφραση μεταξύ ενός κανονικού και ενός καρκινικού κυττάρου. Μπορείτε να κατεβάσετε τις τεχνικές πληροφοριές και προτάσεις για το πώς να χρησιμοποιήσετε τη μικροσυστοιχία στην τάξη από την εκπαιδευτική βάση του ELLS, TeachingBase (“Στην τάξη”) w1.

Εάν έχετε προετοιμάσει τη δραστηριότητα από πριν, τότε η άσκηση θα διαρκέσει μια ώρα. Οι ασκήσεις μπορούν είτε να συζητηθούν στην τάξη είτε να αποτελέσουν πρόσθετη εργασία για το σπίτι.

Υλικά

  • Ένα χαλί αρκετά μεγάλο για να χωρέσει 10 κύκλους (διαμέτρου 35 cm) που αντιπροσωπεύουν τις κουκίδες DNA
  • 5 κόκκινους, 5 πράσινους και 5 κίτρινους κύκλους (διαμέτρου 35 cm), φταγμενους από πλαστικό ή χαρτί
  • Ένα στυλό ή μαρκαδόρο για να σχεδιάσετε και να ονομάσετε τους κύκλους
  • Velcro σε διαφορετικά χρώματα (ένα χρώμα για κάθε γονίδιο), που μπορείτε να κάνετε και μόνοι σας, χρωματίζοντας λευκό Velcro με μαρκαδόρους.
  • 33 πράσινους και 34 κόκκινους μικρούς φακούς και μερικούς επιπλέον. Εμείς χρησιμοποιήσαμε διαφημιστικούς φακούς, που μπορούν να αγοραστούν σχετικά φτηνά. Παρόλα αυτά, οι μαθητές μπορούν να φέρουν τους δικούς τους φακούς και να τους καλύψουν με κόκκινο ή πράσινο χρώμα. Μπορείτε να στερεώσετε τους φακούς σε ένα μικρό ποτήρι ή μολυβοθήκη για να βεβαιωθείτε ότι το φώς θα κατευθύνεται στο ταβάνι. Για εναλλακτικές λύσεις με λιγότερους φακούς κοιτάξτε στην εκπαιδευτική βάση του ELLS, TeachingBase (“Στην τάξη”) w1.
  • 2 κουτιά για να τοποθετήσετε 35 φακους
  • Φωτοτυπίες του πίνακα 1 (διαθέσιμος για κατέβασμα ).
Όνομα γονιδίων (κύκλοι) Χρώμα γονιδίου Συνολική ποσοτητα mRNA για το γονίδιο (αριθμός κομματιων Velcro) Ποσότητα mRNA στο κανονικό κύτταρο (πράσινοι φακοί) Ποσότητα mRNA στο καρκινικό κύτταρο (πράσινοι φακοί)
Πίνακας 1: Τα ονόματα και χρώματα των γονιδίων και η ποσότητα του mRNA που χρησιμοποιείται σε καθένα από τα γονίδια αυτά
alexander fleming   3 0 3
barbara mcclintock   7 1 6
francis crick   18 9 9
jacques monod   4 4 0
james watson   0 0 0
john kendrew   3 2 1
leo szilard   12 9 3
maurice wilkins   6 3 3
rosalind franklin   2 1 1
thomas morgan   12 4 8

Χρησιμοποιήστε ένα δωμάτιο ή μια τάξη που μπορεί να συσκοτισθεί (πχ με κουρτίνες ή περσίδες).

Λεπτομέρεια από μια
κεφαλή εκτύπωσης
μικροσυστοιχιών

Χορηγία εικόνας από EMBL
Photolab

Παραγωγή

Πραγματική

Οι μικροσυστοιχίες DNA εκτυπώνονται σε μικρές πλάκες γυαλιού, παρόμοιες με αυτές των μικροσκοπίων. Η τοποθέτηση μικροσκοπικών κουκίδων στην επιφάνεια του γυαλιού με το χέρι δεν είναι εύκολη υπόθεση, γι’ αυτό και οι επιστήμονες έχουν δημιουργήσει ειδικά ρομπότ. Οι εκτυπωτικές κεφαλές των μηχανών αυτών έχουν ειδικές βελόνες που μεταφέρουν ένα υδατικό διάλυμα DNA από ειδικά δοχεία και το εκτυπώνουν στο γυαλί σε μια διάταξη ειδικών μικρών κουκίδων. Ελέγχοντας τις μηχανές αυτές μπορεί κανείς να ελέγξει όλα τα στοιχεία της συστοιχίας: τον αριθμό, το μέγεθος και την μεταξύ απόσταση των κουκίδων. Περισσότερες από 20 000 κουκίδες μπορούν να εκτυπωθούν σε μια πλάκα, και κάθε κουκίδα περιέχει δισεκατομμύρια αντιγράφων DNA ενός συγκεκριμένου γονιδίου.

Εικονική

  1. Σχεδιάστε 10 κύκλους διαμέτρου 35 cm στο χαλί που αντιπροσωπεύουν τις κουκίδες DNA.
  2. Ονομάστε κάθε κύκλο με βάση τον πίνακα 1, ώστε να αντιπροσωπεύει ενα γονίδιο με το ονομα ενός γνωστού επιστήμονα.
  3. Με βάση τη δευτερη στήλη στον πίνακα 1, κολλήστε τον αντίστοιχο αριθμό κομματιών Velcro (τη μαλακή πλευρά) του ίδιου χρώματος (εάν υπάρχουν περισσότερα κομμάτια δεν υπάρχει πρόβλημα). Τα κομμάτια Velcro αντιπροσωπεύουν τις αλληλουχίες DNA και κάθε χρώμα αντιπροσωπεύει DNA από κάθε γονίδιο. Σημειώστε το χρώμα στον πίνακα.

Απομόνωση mRNA

Πραγματική

Σε ένα πείραμα μικροσυστοιχίας, το πρώτο βήμα είναι η απομόνωση mRNA από κύτταρα δυο καταστάσεων προς μελέτη, όπως είναι για παράδειγμα ένας κανονικός και ένας καρκινικός ηπατικός ιστός. Το mRNA απομονώνεται με μια συνηθισμένη διαδικασία και σημαίνεται μια μια φθορίζουσα χρωστική ουσία: πράσινο για να τα κανονικά κύτταρα και κόκκινο για τα καρκινικά.

Εικονική

Τα σημασμένα, φθορίζοντα μόρια mRNA αντιπροσωπεύονται από τους μικρούς φακούς. Κάθε φακός αντιπροσωπεύει μια απλή αλυσίδα mRNA από ένα γονίδιο. Οι πράσινοι φακοί αντιπροσωπεύουν mRNA από το φυσιολογικό κύτταρο και οι κόκκινοι από το καρκινικό.

  1. Με βάση τον πίνακα 1, κολλήστε το Velcro (τη σκληρή πλευρά) στο κάτω μέρος του αντίστοιχου αριθμού πράσινων και κόκκινων φακών, χρησιμοποιώντας ένα χρώμα Velcro για κάθε γονίδιο.
  2. Σημάνετε ορισμένους επιπλέον φακούς είτε με πολύχρωμες ταινίες Velcro ή Velcro με χρώμα που δεν αντιπροσωπεύεται στην εικονική μικροσυστοιχία. Αυτοί οι φακοί αντιπροσωπεύουν mRNA μόρια που είτε κολλούν ασθενώς είτε καθόλου με το DNA στο χαλί, δηλαδή με τα 10 γονίδιά μας.
  3. Τοποθετήστε όλους τους πράσινους φακούς σε ένα κουτί (κανονικό κύτταρο) και όλους τους κόκκινους σε ένα άλλο (καρκινικό κύτταρο).

Υβριδοποίηση

Πραγματική

Στο βήμα της υβριδοποίσης, τα mRNA του ελέγχου (πράσινα) και του τεστ (κόκκινα) αναμιγνύονται μαζί και τοποθετούνται στην επιφάνεια της μικροσυστοιχίας για να κολήσουν (υβριδοπποιηθούν) με το συμπληρωματικό, ακινητοπιημένο κομμάτι DNA. Τα μορια mRNA με μια αλληλουχία που δεν είναι συμπληρωματική με κάνενα από τα γονίδια δεν θα προσκολληθεί. Αυτά με τη μερικώς συμπληρωματική αλληλουχία DNA από ένα γονίδιο θα προσκολληθούν ασθενώς (μη ειδική υβριδοποίηση). Αυτά τα γονίδια θα απομακρυνθούν με το ακόλουθο βήμα πλυσίματος.

Εικονική

Υβριδοποίηση
Χορηγία εικόνας από EMBL
Photolab
  1. Απομονώστε τους φακούς (μόρια mRNA) από τα κουτιά (κύτταρα), κοιτάξτε το χρώμα από το Velcro και κολλήστε το με το χρώμα από το Velcro στη συστοιχία (το χαλί).
  2. Μερικά μόρια mRNA έχουν χρώματα που δεν ταιριάζουν με κανένα από τα γονίδια και μερικά έχουν πολύχρωμη ταινία που ταιριάζουν ασθενώς με μερικά γονίδια.
  3. Αφαιρέστε τους μη προσκολλημένους και ασθενώς προσκολλημένους φακούς από τη συστοιχία, εκτελώντας ένα εικονικό βήμα πλυσίματος.

Σάρωση

Πραγματική

Τώρα είναι ώρα να κοιτάξουμε τα αποτελέσματα του πειράματος για να δούμε ποιά μόρια έχουν υβριδοποιηθεί με ποιά γονίδια. Επειδή τα μόρια του mRNA δεν είναι αντιληπτά στο γυμνό μάτι, οι επιστήμονες μπορούν μόνο να υπολογίσουν την ποσότητα του mRNA έμμεσα, με τον υπολογισμό του φθορισμού της κάθε κουκίδας. Χρησιμοποιώντας έναν ειδικό σαρωτή με ακτίνες laser, ο πράσινος και κόκκινος φθορισμός ανιχνεύεται ξεχωριστά και δημιουργούνται δυο εικόνες. Με το συνδυασμό των εικόνων αυτών δημιουργείται η χαρακτηριστική εικόνα με τις πολύχρωμες κουκίδες (δείτε τη φωτογραφία δεξιά). Μια κόκκινη κουκίδα υποδηλώνει ότι το γονίδιο είναι ενεργό στο καρκινικο κύτταρο, και μια πράσινη κουκίδα ότι είναι ενεργό στο κανονικό κύτταρο. Μια κίτρινη κουκίδα υποδηλώνει ότι το γονίδιο είναι ενεργό και στους δυο κυτταρικούς τύπους.

Λεπτομέρεια από μια
σαρωμένη μικροσυστοιχία

Χορηγία εικόνας από EMBL
Photolab

Εικονική

  1. Αναψτε τους φακούς και σκοτεινιάστε το δωμάτιο
  2. Ζητείστε από τους μαθητές σας να περιγράψουν τι βλέπουν για κάθε γονίδιο. Πόσους πράσινους ή κόκκινους φακούς έχει το κάθε γονίδιο; Με άλλα λόγια, είναι η έκφραση mRNA διαφορετική στα κανονικά και τα καρκινικά κύτταρα; (πχ υπάρχει ο ίδιος αριθμός κόκκινων και πράσινων φακών σε κάθε κύκλο, είναι η γονιδιακή έκφραση αμετάβλητη;) Ενθαρρύνετε τους μαθητές να βγάλουν τα δικά τους συμπεράσματα.
  3. Εξηγείστε στους μαθητές ότι τα κόκκινα, πράσινα και κίτρινα χρώματα της αληθινής μικροσυστοιχίας εξαρτώνται από την ποσότητα του mRNA στο κύτταρα αυτά. Σημείωση: για το φώς, κόκκινο και πράσινο δημιουργούν κίτρινο ενώ για τις χρωστικές κόκκινο και πράσινο δημιουργούν πορτοκαλί.
  4. Σβήστε τους φακούς, μοιράστε τους κίτρινους κύκλους και ζητήστε από τους μαθητές θα καθορίσουν ποιες κουκίδες θα παρουσιάζονταν κόκκινες, πράσινες ή κίτρινες σε μια πραγματική μικροσυστοιχία, με βάση τον αριθμό των φακών.

Ανάλυση

Πραγματική

Η ανάλυση των μικροσυστοιχιών ξεκινά με την μέτρηση της έντασης του φθορισμού κάθε κουκίδας. Η διαδικασία γίνεται αυτόματα από το σαρωτή. Παρόλο που η ανάλυση των αποτελεσμάτων εξαρτάται από το κάθε πείραμα, ένα τυπικό βήμα είναι η ομαδοποίηση γονιδίων με παρόμοια συμπεριφορά σε μια διαδικασία που ονομάζεται ομαδοποίηση (clustering). Μετά την ομαδοποίηση, οι επιστήμονες προσπαθούν να βρουν ομοιότητες ή διαφορές ανάμεσα στα γονίδια που ανήκουν στην ίδια ομάδα.

Εικονική

  1. Χρησιμοποώντας τον πίνακα 1, ρωτήστε τους μαθητές να ομαδοποιήσουν το γονίδια ανάλογα με τη συμπεριφορά τους στη συστοιχία (Δείτε το “Οδηγός εκπαιδευτικού για τις ασκήσεις ομαδοποίησης” και “Ασκήσεις ομαδοποίησης για την τάξη” στην εκπαιδευτική βάση δεδομένων του ELLS, TeachingBase (“Στην τάξη”) w1.
  2. Συζητήστε τις διαφορετικές λύσεις ομαδοποίησης γονιδίων. Αναφέρετε στους μαθητές ότι δεν υπάρχει σωστή ή λάθος ομαδοποίηση, αλλά ότι τα συμπεράσματα που μπορούν να εξαχθούν από κάθε ομαδοποίηση είναι διαφορετικά.
  3. Ζητήστε από τους μαθητές να ψάξουν για πληροοφορίες σχετικά με τους επιστήμονες των οποίων τα ονόματα χρησιμοποιήθηκαν στα γονίδιά μας, για να δουν εάν τα γονίδια σε μια ομάδα έχουν κάτι κοινό.

Ανάλογα με την ομαδοποίηση, μπορεί να καταληξετε σε μια ομάδα επιστημόνων που ανακάλυψαν τη διπλή έλικα, μια ομαδα γενετιστών, μια ομάδα ερευνητών που έκαναν έρευνα σε μικροοργανισμούς και μια ομάδα επιστημόνων που ήταν υπέυθυνοι για τη δημιουργία του Ευρωπαϊκού Εργαστηρίου Μοριακής Βιολογιας.

Συμπέρασμα

Αφού πραγματοποιήσετε την εικονική μικροσυστοιχία, οι μαθητές μπορούν να συζητήσουν πώς οι μικροσυστοιχίες μπορούν να χρησιμοποιηθούν στη βιοϊατρική έρευνα, καθώς και τις ηθικές επιπτώσεις αυτής της τεχνολογίας. Για περισσότερες πληροφορίες, υπάρχει μια λέσχη ανάγνωσης στην εκπαιδευτική βάση δεδομένων του ELLS, TeachingBase w1, με απλουστευμένες εκδόσεις πραγματικών ερευνητικών άρθρων που περιγράφουν πώς οι μικροσυστοιχίες έχουν χρησιμοποιηθεί για την απάντηση σημαντικών βιολογικών ερωτήσεων.

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς θα ήθελαν να ευχαριστήσουν την Rosanna de Lorenzi για την πραγματοποίηση και τη βελτίωση της δραστηριότητας. Θα ήθελαν επίσης να ευχαριστήσουν την Mehrnooshh Rayner για τα σχόλια της για το άρθρο, τον Thomas Sandmann για τη βοήθειά του στα αρχικά στάδια της εικονικής μικροσυστοιχίας και στον John Watson για συζητήσεις.

Download

Download this article as a PDF

Web References

  • w1 – Για περισσότερες πληροφορίες για την εικονική μικροσυστοιχία στα Αγγλικά, Γερμανικά και Ελληνικά, επισκεφτείτε την εκπαιδευτική βάση TeachingBase του ELLS – μια δωρεάν συλλογή εκπαιδευτικών δραστηριοτήτων σχεδιασμένων για καθηγητές και μαθητές www.embl.org/ells
  • Τα ακόλουθα υλικά της εικονικής μικροσυστοιχίας με τη μορφή PDF είναι σχετικά με αυτό το άρθρο:
  • w2 – Για περισσότερες πληροφορίες για το Ευρωπαϊκό Μαθητικό Εργαστήριο των Βιοεπιστημών, δείτε: www.embl.org/ells
  • w3 – Για περισσότερες πληροφορίες σχετικά με το Ευρωπαϊκό Εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας, δείτε: www.embl.org
  • Μπορείτε να κατεβασετε ένα αρχείο Word με τον πίνακα 1 εδώ.

Institution

EMBL

License

CC-BY-NC-SA