Γρηγορότερα, οικονομικότερα, CRISPR: η νέα επανάσταση της γονιδιακής τεχνολογίας Understand article

Γιώργος Σφλώμος (George Sflomos, B.Sc., M.Sc., Ph.D.) – Τομείς ενδιαφέροντος: Κυτταρική βιολογία και μοριακή ογκολoγία. Μια αμφιλεγόμενη καινούργια τεχνολογία καθιστά τη…

Η εικόνα είναι ευγενική
προσφορά της Νίκολα Γκράφ

Ας υποθέσουμε ότι ενώ γράφεις μια πρόταση συνειδητοποιείς ότι ένα γράμμα έχει γραφτεί λανθασμένα. Το ορθογραφικό λάθος θα τροποποιήσει το νόημα της πρότασης. Για το λόγο αυτό κατευθύνεις τον κέρσορα στο λάθος γράμμα, πατάς το πλήκτρο διόρθωσης backspace και εισάγετε το σωστό γράμμα. Η διαδικασία αυτή είναι πάρα πολύ εύκολη. Είναι εκπληκτικό το γεγονός ότι αυτή η απλή διαδικασία μπορεί τώρα να αναπαραχθεί στα εργαστήρια, όπου οι επιστήμονες αναλαμβάνουν το ρόλο των συγγραφέων και το γενετικό υλικό αντιπροσωπεύει το μήνυμα που θα τροποποιηθεί.

Αυτή είναι η πραγματικότητα που παρουσιάζεται από την CRISPR-Cas9, μια νέα τεχνολογία η οποία τα τελευταία χρόνια και σε σύντομο χρονικό διάστημα έχει αποδειχθεί πάρα πολύ επιτυχημένη. Βέβαια, η αμφιλεγόμενη αυτή τεχνολογία έχει ήδη προβληθεί τόσο πολύ από τα μέσα μαζικής ενημέρωσης που είναι πολύ πιθανόν οι δάσκαλοι σύντομα να δέχονται ερωτήσεις από τους μαθητές τους για την CRISPR-Cas9. Στο άρθρο αυτό παρέχουμε έναν σύντομο οδηγό που εξηγεί τί είναι η CRISPR-Cas9 και για ποιό λογο είναι τόσο σημαντική.

Τι είναι η CRISPR-Cas9

Η CRISPR-Cas9 θα λέγαμε αρχικά ότι είναι ένα σύστημα άμυνας που χρησιμοποιούν τα βακτήρια έναντι των ιικών επιθέσεων, ωστόσο έχει αξιοποιηθεί πρόσφατα ως η τεχνολογία που μπορεί να «ψαλιδίζει» τα γονιδιώματα σε συγκεκριμένα σημεία και με μεγάλη ακρίβεια. Το σύστημα αυτό αποτελείται από δύο συστατικά: το CRISPR και το Cas9. Η λέξη CRISPR προέρχεται από τα αρχικά των λέξεων ‘Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats’ δηλαδή ‘Σύμπλεγμα μικρών παλινδρομικών αλληλουχιών τακτικής χωροκατανομής’ και αναφέρεται σε περιοχές στο γονιδίωμα όπου εντοπίζονται επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες DNA. Κοντά σε αυτές τις επαναλήψεις βρίσκονται τα γονίδια Cas που κωδικοποιούν σημαντικά ένζυμα του συστήματος CRISPR. Ένα από αυτά είναι η νουκλεάση Cas9 – δηλαδή ένα ένζυμο που «κόβει» νουκλεϊκά οξέα (DNA ή RNA).

Όταν ένας ιός επιτίθεται σε ένα βακτήριο, τότε απελευθερώνει το γενετικό του υλικό στο εσωτερικό του βακτηρίου. Το βακτήριο αντιδρά παράγωντας τα ένζυμα Cas προκειμένου να «κόψει» το ιικό νουκλεϊκό οξυ και να το ενσωματώσει στο δικό του γονιδίωμα στις συγκεκριμένες περιοχές CRISPR (εικόνα 1). Η διαδικασία αυτή παρέχει στο βακτήριο πολύτιμη επίκτητη ανοσία: την επόμενη φορά που το ίδιο ιικό στέλεχος θα επιτεθεί, οι περιοχές CRISPR μαζί με το ιικό νουκλεϊκό οξύ  θα αντιγραφούν σε μικρά μόρια RNA. Τα μικρά αυτά μόρια RNA αρχικά θα επικολληθούν στο ένζυμο Cas9 και μετά θα οδηγήσουν το νέο-δημιουργηθέν σύμπλοκο στο εισβαλλόμενο νουκλεϊκό οξύ, εντοπίζοντάς το από την συμπληρωματική αλληλουχία του. Το Cas9 θα τεμαχίσει το στοχευμένο νουκλεϊκό οξύ, και επομένως θα εξουδετερώσει την ικανότητα του ιού να χρησιμοποιήσει το βακτήριο για τη δική του αντιγραφή.

CRISPR-Cas9: the bacterial defence mechanism
Εικόνα 1: CRISPRCas9: Ο βακτηριακός μηχανισμός άμυνας. A: Το ένζυμο Cas9

1. Ιός εισβαλλει σε βακτηριακό κύτταρο; 2. Νουκλεϊκό οξύ προερχόμενο από τον ιό ενσωματώνεται στο βακτηριακό νουκλεϊκό οξύ στην περιοχή CRISPR; 3. Σχηματισμός CRISPR RNA; 4. CRISPR RNA «κολλάει» στο ένζυμο Cas9; 5. Το σύμπλοκο CRISPR RNA καθοδηγεί το ένζυμο Cas9 στον ιό. Κόβει και καταστρέφει το ιικό γονιδίωμα.
Η εικόνα είναι ευγενική προσφορά της Νίκολα Γκράφ

Εικόνα 2: Γονιδιακή
τροποποίηση
χρησιμοποιώντας την
CRISPR
-Cas9. Α: Αλληλουχία
στόχος, Β:
DNA; C: Οδηγός
RNA; D: Cas9; E: Καινούργια
αλληλουχία DNA

1. Ο οδηγός RNA δεσμεύεται
στη αλληλουχία στόχος του

DNA; 2. Το ένζυμο Cas9
δεσμεύεται στην αλληλουχία
οδηγός RNA; 3.
Το ένζυμο
Cas9 «κόβει» και τις 2
αλυσίδες του DNA. 4. Το
βακτηριακό σύστημα
επιδιόρθωσης εισάγει
καινούργιο DNA στις
«κομμένες» αλυσίδες,
αντικαθιστώντας την αρχική
αλληλουχία DNA.

Η εικόνα είναι ευγενική
προσφορά του Nicola Graf

Πώς έγινε όμως και αυτό το βακτηριακό σύστημα προσαρμόστηκε στο να μας παρέχει καινούργια γενετική τεχνολογία? Το 2012, οι ερευνητικές ομάδες της Δρ. Τζένιφερ Ντούντα στο Πανεπιστήμιο Μπέρκλεϋ της Καλιφόρνιας στις Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής και αργότερα η Δρ. Εμμανουέλ Σαρπεντιέ, στο Σουηδικό Πανεπιστημιο της Ουμέας, τροποποίησαν και τοποθέτησαν μαζί τα μικρά μόρια RNA σε ένα «οδηγό» RNA (εικόνα 2). Αυτό διατήρησε το ένα άκρο που θα μπορούσε να συνδεθεί με το Cas9, ενώ οι αλληλουχίες στο άλλο άκρο θα μπορούσαν να συζευχθούν με οποιαδήποτε γνωστό DNA στόχο. Με αυτήν την ικανότητα προσαρμογής, η CRISPR-Cas9 μπορούσε πλέον να «κόβει» ειδικά επιλεγμένες αλληλουχίες του DNA. Λίγο αργότερα, το εργαστήριο του Δρ. Φένγκ Ζάνγκ στο τεχνολογικό ινστιτούτο της Μασαχουσέτης, ΗΠΑ, ανέπτυξε περαιτέρω την CRISPR-Cas9 αναδεικνύοντας την ικανότητά της για ακριβή γονιδιωματική περικοπή σε κύτταρα τόσο ποντικού όσο και ανθρώπου (Κόνγκ και λοιποί συγγραφείς, 2013). Επιπλέον, τροποποίησαν το ένζυμο Cas9 έτσι ώστε να «κόβει» το DNA με έναν ελαφρώς διαφορετικό τρόπο, μέσω δηλαδή της ενεργοποίησης ενός ειδικού μηχανισμού επιδιόρθωσης του DNA στα κύτταρα. Αυτό σημαίνει ότι οι ερευνητές εισήγαγαν με επιτυχία μια νέα αλληλουχία DNA ακριβώς στο σημείο «κοπής», αντικαθιστώντας έτσι την αρχική αλληλουχία.

Με αυτές τις πρωτοποριακές προσπάθειες, η CRISPR-Cas9 μεταμορφώθηκε από ένα αρχικά εξειδικευμένο θέμα στον τομέα της μικροβιολογίας, σε ένα συναρπαστικό εργαλείο έρευνας που καθιστά τους ερευνητές ικανούς να τροποποιούν γονίδια για διαφορετικούς σκοπούς με μεγάλη ακρίβεια και ευκολία.

Σε τι χρησιμεύει?

Για τη μελέτη της γενετικής λειτουργίας, οι επιστήμονες συχνά προσπαθούν να παράγουν κυτταρικές σειρές ή οργανισμούς πρότυπα στα οποία το γονίδιο που μας ενδιαφέρει είναι είτε μεταλλαγμένο, είτε απενεργοποιημένο (η τεχνική είναι γνωστή ως γονιδιακή απαλειφή). Η CRISPR-Cas9 παρέχει έναν γρήγορο και ακριβή τρόπο για να γίνει αυτό. Επιπροσθέτως, το ένζυμο Cas9 μπορεί να τροποποιηθεί έτσι ώστε να χάσει την ικανότητα κοπής του DNA και την ίδια στιγμή να εξακολουθεί να στοχεύει και να δεσμεύεται στις ειδικές αλληλουχίες DNA, χάρη στον οδηγό RNA. Αυτό οδηγεί στο φυσικό «μπλοκάρισμα» της σύνδεσης της RNA πολυμεράσης, επιτρέποντας έτσι τους επιστήμονες να ελέγχουν τη γονιδιακή μεταγραφή – δηλαδή το αρχικό στάδιο για τη δραστικότητα ενός γονιδίου.

Ενώ αυτές είναι σημαντικές τεχνικές στη βιοϊατρική έρευνα, η CRISPR-Cas9  υποσχέται ακόμη πιό άμεσες εφαρμογές στον τομέα της υγειονομικής περίθαλψης. Οι επιστήμονες εχουν ήδη χρησιμοποίησει την τεχνική της γονιδιακής επεξεργασίας CRISPR-Cas9 για την αποκοπή αλληλουχιών του ιού HIV και τη μή δυνατότητα αναπαραγωγής του σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές. Επίσης η τεχνική έχει χρησιμοποιηθεί για την αφαίρεση μεταλλαγμένων αλληλουχίων από  ποντίκια που πάσχουν από μυϊκή δυστροφία Duchenne, μια αδυναμία που προκαλεί μυική εξασθένηση αναδεικνύοντας με τον τρόπο αυτό νεές θεραπευτικές ελπίδες για τους ασθενείς και τις οικογένειές τους που πάσχουν από αυτήν ή και παρόμοιες γενετικές ασθένειες. Πρόσφατα, έμβρυα χοίρου εχούν υποστεί εκτεταμένη γονιδιακή επεξεργασία χρησιμοποιώντας την CRISPR-Cas9 με την ελπίδα ότι θα παράσχουν ασφαλέστερα όργανα για ανθρώπινες μεταμοσχεύσεις.

Επομένως, αν η γονιδιακή τροποποίηση έχει ήδη γίνει στα έμβρυα χοίρου, θα μπορούσε επίσης να πραγματοποιηθεί και σε ανθρώπινα έμβρυα; Αυτό ακριβώς έκαναν Κινέζοι ερευνητές το 2015, όταν χρησιμοποίησαν την CRISPR-Cas9 για να τροποποιήσουν το γονίδιο της β-θαλασσαιμίας σε 86 ανθρώπινα έμβρυα (Σιρανόσκι & Ρίρντον, 2015). Η τεχνική αποδείχθηκε ότι ήταν μάλλον αναποτελεσματική, καθώς η αλληλουχία DNA άλλαξε με επιτυχία σε λιγότερο από το ένα τέταρτο των εμβρύων. Παρόλα αυτά, η ανακοίνωση του ευρήματος αυτού δημιούργησε μεγάλη διαμάχη λόγω των ηθικών επιπτώσεων.

Ηθικά ζητήματα – και το μέλλον

Οι ηθικές ανησυχίες δεν αφορούν μόνο τα πειράματα σε ανθρώπινα εμβρύα, αλλά επίσης και για την αμφιλεγόμενη προοπτική χρήσης της στη μηχανική της βλαστικής σειράς. Με την CRISPR-Cas9, είναι θεωρητικά δυνατόν να πραγματοποιηθούν γενετικές αλλαγές στα γεννητικά κύτταρα (σπερματοζωάρια και ωάρια), οι οποίες θα μπορούσαν να περάσουν στις μελλοντικές γενιές. Ενώ αυτή η ιδέα έχει μεγάλες προπτικές για την εξάλειψη γενετικών ασθενειών, εγείρει επίσης το ζήτημα για το ποιές τροποποιήσεις θα μπορούσαν να επιτρέπονται ως ιατρικές θεραπείες στο μέλλον. Θα μπορούσαν για παράδειγμα ανθρώπινα χαρακτηριστικά όπως η νοημοσύνη ή το χρώμα των ματιών να θεωρηθούν κατάληλα για ιατρικές επεμβάσεις. Αυτοί οι φόβοι μπορεί να φαίνονται υπερβολικοί, αλλά υπάρχει και μια άλλη ανησυχία: ότι η μηχανική της βλαστικής σειράς θα μπορούσε να έχει εντελώς απροσδόκητες και μη αναστρέψιμες επιπτώσεις στις μελλοντικές γενιές. Αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό από τη στιγμή που και η πρόσφατη γενετική έρευνα στο χώρο της γενετικής έχει διαπιστώσει ότι οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ γονιδίων και άλλων κληρονομικών μηχανισμών είναι πολύ πιο περίπλοκες από ό,τι προηγουμένως αναμενόταν.

Οι επιπτώσεις αυτές δεν έχουν διαφύγει της προσοχής των επιστημόνων. Κάποιοι συμφωνούν ότι η μηχανική της βλαστικής σειράς βρίθει από κανόνες δεοντολογίας και πιστεύουν ότι οποιαδήποτε έρευνα χρησιμοποιώντας την CRISPR-Cas9 στη χρήση ανθρώπινων εμβρύων πρέπει να αποτραπεί. Άλλοι, ωστόσο, πιστεύουν ότι ένα πλήρες μορατόριουμ δεν θα είναι μόνο δύσκολο να επιβλήθει, αλλά θα μπορούσε επίσης να εμποδίσει την πρόοδο της έρευνας. Παρά τις διαφορετικές απόψεις, η επιστημονική κοινότητα έχει αποφασίσει να ακολουθήσει το δρόμο του διαλόγου και της διαφάνειας, όπως αποδεικνύεται από τις πολλές συνόδους κορυφής και συναντήσεις που λαμβάνουν χώρα για το θέμα αυτό σε ολόκληρο τον κόσμο.

Εν τω μεταξύ, η ανάπτυξη της CRISPR-Cas9 συνεχίζεται με ραγδαίους ρυθμούς. Οι φαρμακευτικές εταιρείες επενδύουν στην τεχνολογία που θα βοηθήσει την έρευνα για την ανάπτυξη φαρμάκων και οι τεχνικές ατέλειες διορθώνονται και η τεχνολογία βελτιώνεται – ενώ την ίδια στιγμή μια διαμάχη για το δίπλωμα ευρεσιτεχνίας λαμβάνει χώρα ανάμεσα στους πρωτοπόρους της τεχνολογίας (Ντούντα/Σαρπεντιέ και Ζάνγκ). Ανεξάρτητα από το τι συμβαίνει εκεί, η ραγδαία άνοδος της CRISPR-Cas9 μόλις τώρα αρχίζει.

Download

Download this article as a PDF

References

Resources

Author(s)

Ο Χόρας Τσάν απέκτησε τον μεταπτυχιακό του τίτλο στη μοριακή και κυτταρική βιολογία από το Πανεπιστήμιο της Χαϊδελβέργης στη Γερμανία. Σήμερα εργάζεται ως εκπαιδευόμενος στον τομέα της επικοινωνίας στο Γερμανικό κεντρο έρευνας για τον καρκίνο, στη Χαϊδελβέργη, ενώ στο παρελθόν είχε εργαστεί πάνω σε επιστημονικά άρθρα για το ηλεκτρονικό περιοδικό Ασιατικός επιστήμονας, σχετικά με ερευνητικά θέματα προερχόμενα από την περιοχή της Ασίας-Ειρηνικού.


Review

Η τεχνολογία CRISPR-Cas9 είναι ένα ισχυρό εργαλείο γονιδιακής επεξεργασίας παρόμοιο με το GPS. Έχει τη δυναμική να ανοίξει τις πόρτες της πρόδου σε πολλές επιστημονικές, ιατρικές και γεωργικές εφαρμογές. Η σχετική ευκολία και το χαμηλό κόστος της εγείρει πολλά ηθικά ζητήματα. Έχει επίσης οδηγήσει σε μια υψηλού προφίλ δικαστική αγωγή μεταξύ επιστημόνων σχετικά με τα πολύτιμα δικαιώματα ευρεσιτεχνίας.

Το άρθρο αυτό περιγράφει με ενάργεια τον προσδιορισμό παλινδρομικών αλληλουχιών ως βασικό σύστημα βακτηριακής άμυνας για την εφαρμογή του εργαλείου γονιδιακής επεξεργασίας CRISPR-Cas9. Το άρθρο αυτό μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να εξηγήσει, με τη συνδρομή κινούμενων σχεδίων, τις τεχνικές της μοριακής βιολογίας που εμπλέκονται και γιατί η CRISPR-Cas9 έχει αντικαταστήσει προγενέστερες τεχνικές. Μπορεί επίσης να αποτελέσει τη βάση για συζητήσεις γύρω από ηθικά ζητήματα αναφορικά με την τροποποίηση της βλαστικής σειράς και της πνευματικής ιδιοκτησίας. Ερωτήσεις κατανόησης γύρω από το άρθρο:

  • Από πού προέρχονται τα αρχικά της λέξης CRISPR?
  • Πώς λειτουργεί η CRISPR-Cas9?
  • Τι είδους ασθένειες μπορούν να θεραπευτούν χρησιμοποιώντας την CRISPR-Cas9?
  • Ποιές είναι οι πιθανές προκλήσεις χρησιμοποιώντας την CRISPR-Cas9?
  • Ποια είναι τα ηθικά διλήμματα που εγείρονται γύρω από τη χρήση της CRISPR-Cas9?
  • Ποιος-ά πρέπει να τιμηθεί με το βραβείο Nobel για την ανακάλυψη της τεχνικής CRISPR-Cas9?

Μαίρη Μπρέναν, Κολέγιο Κόνκορντ, Ηνωμένο Βασίλειο




License

CC-BY