TДва хидролазни ензими и един философско-исторически подход

ПРЕВОД Райчо ДИМКОВ

Авторката, Изабела Марини, със своите ученици от Научния лицей Улисе Дини, Пиза Схемата е предоставена с любезното съгласие на И.Марини

Защо ензимите са така специфични? По какво се различават те от неорганичните катализатори? Изабела Марини от Университета на Пиза , Италия, предлага едно подходящо за урочна работа описание, позволяващо на учениците сами да си отговорят на тези въпроси.

Могат ли историята и философията да ни помогнат в преподаването на научни знания?

Когато учениците почната да учат за химичните реакции, те разсъждават не като химици, а като алхимици: когато видят химична реакция, те мислят от гледна точка на трансмутацията (както са правели алхимиците), а не с езика на трансформацията (както прави съвременният химик). Докато учат, те проследяват развитието на човешкото познание; това е един критичен процес, който не може да бъде подценяван.

Макар че не е необходимо учителите да изнасят отделни уроци върху историята на науката, те са длъжни да са наясно за нейната важност. Историята и философията на науката (т.нар. епистемология) са с фундаментално значение тъй като, заедно с психологията, ни помагат да разберем какво се изисква на всеки етап от образователния процес. Признанието, че от стотици години хората наблюдават и погрешно тълкуват определени явления и че разрешаването на тези комплексни проблеми формира основите на науката, ни помага да разберем, че много аргументи са непонятни за нашите ученици при липса на последователен подход към новите схващания.

При въвеждането на идеята за ензимите пред по- долните класове на средното училище аз исках учениците да открият за себе си кое прави енизмите толкова специфични и толкова важни. Избрах амилазата и инвертазата, два достъпни ензима, чиято каталитична активност лесно може да бъде открита без никакви инструменти, ако се изключат очите.

Някои исторически данни

Покълнали ечемичени зърна за изолиране на β-амилаза Схемата е предоставена с любезното съгласие на И.Марини

През 1835 г. Берцелиус демонстрирал, че извлекът от покълнал ечемик катализира хидролизата на скорбялата по-успешно отколкото сярната киселина.Той предложил новия термин „катализа”, показвайки, че много малки количества от катализатора повишават скоростта на определена реакция без при това да бъдат изразходвани. По такъв начин би могла да се обясни скоростта  на биохимичните реакции; специфични катализатори в клетките са способни да функционират при меки условия. Същата идея е залегнала в основата на тези експерименти.

Амилази

За да използва въглерода и енергията на скорбялата, храносмилателната система на човека трябва първо да разкъса полимера на по-малки захари. α-амилазата от слюнка (1,4-α-D-глюкан глюканохидролаза, с шифър по номенклатурата на Комисията за ензими ЕС 3.2.1.1) започва разграждането на полизахаридите още в устата (процесът се довършва в тънките черва от амилазата на панкреаса). Това е мономерен свързан с калций глюкопротеин, който хидролизира на случаен принцип α-1,4- глюкозидните връзки в скорбялата (вж фигурата).

β-амилазата (1,4-α-D-глюкан малтохидролаза, ЕС 3.2.1.2 ) катализира хидролизата на α-1,4- глюкозидните връзки в скорбялата, отстранявайки последователно малтозните единици от нередуцираните краища на веригите. Това е един от големите белтъци, намерен в скорбялния ендосперм на зърното от ечемика (Hordeum vulgare) и е ключов ензим за  разграждането на скорбялата при производството на бира.

Инвертаза

Инвертазата или захаразата (захароза-α-D-глюкохидролаза; ЕС 3.2.1.48) катализира хидролизата на захарозата и малтозата. Захарозата, по-известна като цвеклова или тръстикова захар, е дизахарид, съставен от една молекула α-D-глюкоза и една молекула β-D-фруктоза, свързани с α-1-β-2-глюкозидна връзка. Когато тази връзка се хидролизира, получава се еквимоларна (равномерна) смес от глюкоза и фруктоза. В хлебопекарските и пивни дрожди (Saccharomyces cerevisiae) инвертазата съществува в две форми – вътреклетъчна и извънклетъчна.

Описание на лабораторното занятие

Материали

• Фосфатен буфер, 50 mM, рН 7 (буфер А). Приготвя се като се разтварят 3,55 g бибазичен фосфат (Na₂HPO₄) в дестилирана вода и се титрува със солна киселина  (HCl)  до рН 7,0 (с помощта на рН-метър). След това чрез доливане на дестилирана вода крайният обем се довежда до 500 ml.
• В буфер А се добавят следните разтвори: на  скорбяла-10 g/L, 0,1 М захароза, 0,1 М фруктоза.
• Разтвор на йод -   N/50. Приготвя се като към 20 g KI  и 12,7 g  йод се прибавя дестилирана вода, така че крайният обем да стане 1 L . Този разтвор се разрежда накрая с дестилирана вода в съотношение 1:5.
• Разтвори на Фелинг – разтвор А (7g CuSO4  в 100 mL дестилирана вода) и разтвор В (34 g  калиево-натриев тартарат и 12g NaOH  в  100 mL дестилирана вода).
• 5 М разтвор на натриева основа (NaOH)
• 5 М разтвор на солна киселина (HCl)
• Слюнка. Алфа-амилазата в слюнката е вече в  разредено състояние и не изисква хомогенизиране. Тя просто се разрежда с буфер А в съотношение 1:10.
• Ечемичени семена. Хомогенизирайте покълнали зърна от ечемик (3-5 дни след засяването) чрез стриване в хаванче с буфер А   (около 1g  зърна / mL  буфер). Центрифугирайте екстракта при 15 000 g  за 5 минути; течността се използва като проба от бета-амилаза. Ако нямате достъп до центрофуга,  филтрувайте сместа и използвайте филтрата.
• Дрождеви разтвор – 0,4 g/L в буфер А (хлебна мая, която може да купите от супермаркета).

Методи

Йоден метод

Йодът във воден разтвор със скорбяла образува синьо-виолетов комплекс с висока чувствителност и специфичност. Малтозата и фруктозата в присъствие на йод остават безцветни.

Метод на Фелинг

Когато в присъствие на редуциращи захари (например като глюкоза или фруктоза, но не и захароза или скорбяла) се нагрее алкален разтвор на медни йони, двувалентната мед се редуцира до едновалентна. В резултат на това се образува жълто-червена утайка от купрооксид (Cu₂O).

Процедури

За да демонстрирате тестовите методи, тестувайте всичките четири захарни разтвори (на скорбяла, захароза, глюкоза и фруктоза) и с двата метода – йодния и Фелинговия. Скорбялата е субстрат на амилазата; захарозата е субстрат на инвертазата, докато глюкозата ифруктозата са продуктите от реакциите, които тези два ензима катализират.

Амилази

Хидролизата на скорбялата се доказва или по изчезването на синьото оцветяване в присъствие на йоден разтвор, или чрез жълто-червената утайка с теста на Фелинг.

Както за α-амилазата (от слюнка), така и за β-амилазата (от ечемичения екстракт) пригответе по седем епруветки. Смесете в тях по 2 мл буфер А с 400 μL скорбелен разтвор. След това третирайте всяка епруветка както е описано в табл. 1.

Табл.1: Обработка на пробите за α-амилаза (от слюнка) и за β-амилаза (от ечемик)
* Прибавете една капка NaOH преди теста по Фелинг.
** Нагрейте този разтвор на слюнка или ечемик на спиртна лампа за 3 мин преди да го добавите в епруветката
.

Разделете съдържанието на всяка епруветка на две части: тестувайте едната с 2 капки йод, а другата – с по 500 μL от разтворите на Фелинг А и В. Нанесете резултатите от опита в табл. 3. За да тествате амилазата за специфичност, повторете процедурата за епруветка № 5 като замените слюнката с 300 μL дрождев разтвор (дрождите не съдържат амилази).

Седемта епруветки след йодния тест за амилазна активност Схемата е предоставена с любезното съгласие на И.Марини

Инвертаза

Пригответе седем епруветки като смесите 1 мл буфер А и 0,5 мл разтвор на захароза. След това  третирайте всяка епруветка, както е посочено в табл.2.

Табл.2: Обработка на пробите за инвертаза
* Прибавете 1 капка NaOH преди теста на Фелинг.
** Нагрейте този дрождев разтвор на спиртна лампа за 3 мин преди прибавянето.

Тествайте всяка епруветка с 500 μL Фелинг А и 500 μL Фелинг В.

Нанесете резултатите от опита в табл.3.

Табл.3: Резултати от опита

За да  тествате инвертазата за специфичност,повторете процедурата за епруветка № 5 като заместите дрождевия разтвор с 500 μL разредена 1:10 слюнка.

Безопасност

Тест на Фелинг заглюкоза (вляво) и за захароза (вдясно) Схемата е предоставена с любезното съгласие на И.Марини

При тези опити не се използват и не се получават вредни реагенти с изключение на HCl или  NaOH. Само заради тях и заради слюнката трябва да се работи с лабораторни ръкавици. Йодът трябва да се претегли внимателно като се използва и безопасна маска, тъй като той лесно сублимира. Внимание се изисква и при загряването на епруветките със спиртна лампа и при разтварянето на скорбялата в топлия буфер.

Очаквани резултати

Екстремалните условия, създадени едновременно от нагряването и добавянето на солна киселина, правят възможна хидролизата на скорбялата и захарозата. Поотделно приложени обаче, нито загряването, нито подкисляването са ефективни.

При меки условия (без загряване и без солна киселина) слюнката и екстрактите от ечемик и дрожди хидролизират своите субстрати. Както загряването, така и добавянето на солна киселина, предпазват от хидролиза защото екстрактите са термолабилни и чувствителни спрямо рН.

Обсъждане

Сравнението между екстремалните условия, необходими за химичната катализа (висока температура и екстремално рН) и меките условия, изисквани от биологичните екстракти, изграждат в учениците идеята за „специално и мощно вещество”, присъстващо в живите организми. То е термонеустойчиво, специфично (за разлика от неорганичните катализатори) и способно да катализира реакциите. По такъв начин учениците от горните класове могат да изминат пътя на историческото развитие на знанията ни за ензимите. Понятието „ензим”  няма повече да им изглежда мъгляво, защото „думите могат да обособят и да съхранят едно понятие само когато то предварително е било въвлечено в нашето пряко общуване с нещата” (Dewey, 1910).

Благодарности

Искам да благодаря на професор Умберто Мура от Департамента по физиология и биохимия в Университета на Пиза за това, че той постоянно ме окуражаваше. Специални благодарности дължа на професор Розана Стриколи за английската редакция на ръкописа, а също -  на моите ученици за техните точни наблюдения и съмнения.

Литературни източници

Dewey J (1910) How we think. Boston, MA, USA: D.C. Heath & Co

Payen A, Persoz JF (1833) Mémoire sur la diastase, les principaux produits de ses reactions et leur applications aux arts industriels. Annales de chimie et de physique 53: 73-92

Повече

Marini I (2005) Discovering an accessible enzyme: salivary α-amylase. Prima digestio fit in ore: a didactic approach for high school students. Biochemistry and Molecular Biology Education 33: 112-116. doi:10.1002/bmb.2005.494033022439

Inhelder B, Piaget J (1958) The Growth of Logical Thinking from Childhood to Adolescence. New York, NY, USA: Basic Books

Voet D, Voet JG (2004) Biochemistry, 3rd Edition. Hoboken, NJ, USA: J. Wiley & Sons

van der Maarel MJ et al. (2002) Properties and applications of starch-converting enzymes of the alpha-amylase family. Journal of Biotechnology 94: 137-155. doi:10.1016/S0168-1656(01)00407-2