Dwa enzymy hydrolityczne a podejście historyczno- epistemologiczne Teach article

Tłumaczenie Joanna Lilpop, Szkoła Festiwalu Nauki. Dlaczego enzymy są tak nadzwyczajne? W jaki sposób ich działanie różni się od działania katalizatorów nieorganicznych? Isabella Marini z University of Pisa we Włoszech opisuje szkolne protokoły doświadczeń pozwalające studentom…

Autorka, Isabella Marini ze
swoimi studentami w Liceo
Scientifico Ulisse Dini, Pisa

Dzięki uprzejmości Isabelli
Marini

Czy historia i epistemologia mogą pomóc w nauczaniu myślenia naukowego?

Gdy uczniowie zaczynają uczyć się o procesach chemicznych, rozumują nie jak chemicy, ale jak alchemicy: gdy obserwują reakcję chemiczną myślą w kategoriach przemiany (tak jak czynili to alchemicy), a nie przekształcenia, jak postrzegają to współcześni chemicy. Podczas nauki uczniowie przemierzają tę samą drogę, którą przeszedł rozwój ludzkiej wiedzy i proces ten jest bardzo istotny, nie możemy o nim zapominać.

Choć nauczyciele nie muszą prowadzić specjalnych lekcji na temat historii nauki, warto, aby zdawali sobie sprawę z wagi tego zagadnienia. Historia nauki i epistemologia, czyli teoria poznania, wraz z psychologią, są bardzo ważne, ponieważ pomagają nam zrozumieć wymagania naszego umysłu na poszczególnych etapach procesu edukacji. Trzeba zdać sobie sprawę, że ludzie obserwując niektóre zjawiska źle je interpretowali przez setki lat, a rozwiązanie takich złożonych problemów stanowi podstawę współczesnej wiedzy. Dzięki temu możemy sobie uświadomić, dlaczego wiele argumentów jest niezrozumiałych dla uczniów bez stopniowego wprowadzania w nowe koncepcje myślowe.

Wprowadzając pojęcie enzymów na poziomie gimnazjów chciałam, aby uczniowie sami odkrywali co sprawia że enzymy są tak niezwykłe i dlaczego są ważne. Wybrałam dwa łatwo dostępne enzymy – amylazę i inwertazę, których aktywność katalityczną łatwo można zaobserwować bez użycia specjalnych urządzeń, wystarczą po prostu oczy.

Kilka faktów historycznych

Schemat budowy skrobi.
Amylaza katalizuje hydrolizę
wewnętrzną wiązań α(1-4)
glikozydowych

Dzięki uprzejmości Isabelli
Marini

Rosyjski chemik Gottlieb Kirchhoff w 1812 roku przeprowadził hydrolizę skrobi podgrzewając ją z kwasem siarkowym. Zaskoczeniem było to, że pH roztworu po reakcji nie różniło się, sugerując, że kwas nie był substratem tej reakcji, chociaż jego obecność była niezbędna do przebiegu reakcji.

Dwie dekady później Anselme Payen i Jean-François Persoz wyizolowali z kiełkujących ziaren jęczmienia, za pomocą wytrącania w etanolu, białą, rozpuszczalną w wodzie substancję (A. Payen & J.F. Persoz, 1833). Substancji tej, zdolnej przeprowadzić hydrolizę skrobi, dali nazwę diastaza. Później jej nazwa została zmieniona na amylaza, lecz charakterystyczna końcówka –aza pozostała dla wielu enzymów, jakie znamy.

W 1835 roku Jöns Berzelius udowodnił, że ekstrakt z kiełkującego jęczmienia dużo efektywniej przeprowadza proces hydrolizy skrobi niż kwas siarkowy. Wprowadził pojęcie „katalizy” – czyli zjawiska, w którym obecność małej ilości katalizatora podwyższa wydajność reakcji, przy czym sam katalizator nie jest zużywany. A zatem wysoka wydajność reakcji biochemicznych może być w ten sposób wytłumaczona, specjalne katalizatory w komórkach są zdolne działać w stałych warunkach. Ta sama myśl przyświeca poniższym doświadczeniom.

Amylazy

Aby użyć skrobi, jako źródła węgla i energii, ludzki układ pokarmowy musi najpierw rozerwać polimer na mniejsze jednostki cukrowe. α-amylaza ślinowa (wg klasyfikacji Komisji Enzymów otrzymała numer EC 3.2.1.1) rozpoczyna w jamie ustnej trawienie polisacharydów (proces jest kończony w jelicie cienkim przez amylazę trzustkową). Alfa-amylaza jest monomerem, glikoproteiną związaną z jonem wapnia, która losowo hydrolizuje wiązania α(1,4) glikozydowe w skrobi (patrz diagram).

β-amylaza (EC 3.2.1.2) katalizuje hydrolizę wiązań α(1,4)glikozydowych w skrobi, odłączając kolejne cząsteczki maltozy od strony nie zredukowanego końca łańcucha. Jest głównym enzymem znajdującym się w skrobiowym bielmie ziaren jęczmienia (Hordeum vulgare), a także enzymem odgrywającym kluczową rolę w procesie warzenia piwa degradującym skrobię słodu.

Inwertaza

Inwertaza, albo sacharaza (EC 3.2.1.48) katalizuje hydrolizę sacharozy i maltozy. Sacharoza, potocznie zwana białym cukrem jest disacharydem złożonym z cząsteczki α-D-glukozy I cząsteczki β-D-fruktozy połączonych wiązaniem α1-β2 glikozydowym. Po rozerwaniu wiązania powstaje równomolarna mieszanina cząsteczek glukozy i fruktozy (patrz diagram). U drożdży (Saccharomyces cerevisiae) inwertaza znajduje się zarówno w komórce, jak i jest wydzielana zewnątrz.

Protokół dla klasy

Materiały

  • 50 mM bufor fosforanowy o pH 7 (bufor A). Przygotowanie: 3,55 g fosforanu dwuzasadowego (Na2HPO4) rozpuść w odrobinie wody destylowanej i doprowadź używając pH-metru do pH 7.0 za pomocą kwasu solnego (HCl), następnie dopełnij roztwór wodą destylowaną do objętości 500 ml.
  • Roztwory w buforze A: skrobia 10g/L, sacharoza 0,1 M, glukoza 0,1 M, fruktoza 0,1 M.
  • Roztwór jodyny. Przygotowanie: do 20 g KI i 12,7 g jodu dodaj wody destylowanej do końcowej objętości 1 litra. Tak przygotowany roztwór rozcieńcz 1:5 wodą destylowaną.
  • Roztwory Fehlinga A (7 g siarczanu(VI) miedzi(II) (CuSO4) na 100 ml wody destylowanej) i B (34 g winianu sodowo potasowego [sól sodowo-potasowa kwasu winowego, wzór sumaryczny (CHOHCOO)Na(CHOHCOO)K, nr katalogowy dodatku do żywności: E337, przyp. tłum.] i 12 g NaOH na 100 ml wody destylowanej).
  • 5 M wodorotlenek sodu (NaOH)
  • 5 M kwas solny (HCl)
  • Ślina. W ślinie rozpuszczona jest α-amylaza, nie wymaga homogenizacji. Może być po prostu rozcieńczona 1:10 za pomocą buforu A.
  • Nasiona jęczmienia.  Kiełkujące ziarna jęczmienia należy homogenizować (trzy do pięciu dni po wysianiu) przez zmielenie w moździerzu razem z buforem A (około 1 g ziaren na 1 ml buforu). Odwiruj ekstrakt przez 5 minut (przy 15000 g); uzyskany płyn używany jest jako źródło β-amylazy. Jeśli nie masz dostępu do wirówki, możesz przefiltrować homogenat i użyć przesączu.
  • Roztwór drożdży: 0,4 g/l rozrobione w buforze A (drożdże piekarnicze mogą być kupione w sklepie spożywczym)

Metody

Metoda jodynowa

Wodny roztwór jodu tworzy barwny, niebiesko-granatowy kompleks ze skrobią. Kompleks ten jest wysoce specyficzny, dzięki czemu metoda jest bardzo czuła. Natomiast maltoza i glukoza są bezbarwne w obecności jodu.

Metoda Fehlinga

Alkaliczny roztwór dwuwartościowych jonów miedzi (Cu2+) podgrzany w obecności cukrów redukujących (takich jak glukoza, czy fruktoza, natomiast nie sacharoza i skrobia) jest redukowany do jonów jednowartościowych (Cu+), tworząc żółto-czerwony osad tlenku miedzi (Cu2O).

Procedury

Aby zademonstrować metody, przetestuj cztery roztwory węglowodorów (skrobi, sacharozy, glukozy i fruktozy) za pomocą metody jodynowej i Fehlinga. Skrobia jest substratem dla amylazy, sacharoza dla inwertazy, podczas gdy glukoza i fruktoza są produktami reakcji katalizowanych przez te enzymy.

Amylazy

Hydroliza skrobi może być pokazana poprzez zanikanie niebieskiego zabarwienia w obecności jodyny lub przez pojawianie się żółto-czerwonego osadu w teście metodą Fehlinga.

Zarówno dla a-amylazy (ślina) jak i dla b-amylazy (ekstrakt z ziaren jęczmienia) przygotuj siedem probówek zawierających mieszaninę 2 ml buforu A z 400 µl roztworu skrobi.

Nr probówki HCl Ślina lub ekstrakt z ziaren jęczmienia Podgrzewanie palnikiem gazowym Bunsena przez: Pozostawienie w temperaturze pokojowej przez:
Tabela 1: Procedura dla α-amylazy (ślina) i β−amylazy (ekstrakt z ziaren jęczmienia)
* dodaj kroplę NaOH przed testem Fehlinga
** Podgrzej roztwór śliny/jęczmienia na palniku gazowym przez 3 minuty przed dodaniem do probówki
1* 2 krople   5 min  
2* 2 krople     5 min
3     5 min  
4       5 min
5   0.5 mL   5 min
6* 2 krople 0.5 mL   5 min
7   0.5 mL**   5 min

Podziel zawartość każdej probówki na dwie części: do jednej dodaj 2 krople jodyny, do drugiej dodaj 500 µl roztworu Fehlinga A i 500 µl roztworu Fehlinga B. Zanotuj wyniki testów w tabeli 3.

Aby sprawdzić specyficzność działania amylazy, powtórz procedurę dla probówki nr 5 dodając zamiast śliny 300 µl roztworu drożdży (drożdże nie zawierają amylazy).

Inwertaza

Przygotuj siedem probówek zawierających mieszaninę 1 ml buforu A i 0,5 ml roztworu sacharozy. Następnie traktuj probówki zgodnie z wytycznymi tabeli nr 2.

Nr probówki HCl Ekstrakt drożdżowy Podgrzewanie na palniku gazowym Bunsena przez: Pozostawienie w temperaturze pokojowej:
Tabela 2: Procedura dla inwertazy
* Dodaj jedną kroplę NaOH przed testem Fehlinga
** Przed dodaniem podgrzej roztwór drożdży na palniku gazowym przez 3 minuty
1* 1 kropla   5 min  
2* 1 kropla     5 min
3     5 min  
4       5 min
5   1 mL   5 min
6* 1 kropla 1 mL   5 min
7   1 mL**   5 min

Przetestuj każdą probówkę za pomocą 500 µl roztworu Fehlinga A i 500 µl roztworu Fehlinga B.

Zanotuj wyniki w tabeli 3.

Probówka

a-amylaza (ślina)

b-amylaza (ekstrakt z ziaren jęczmienia)

Inwertaza

Test jodynowy

Test Fehlinga

Test jodynowy

Test Fehlinga

Test Fehlinga

Tabela 3: Wyniki testów
1          
2          
3          
4          
5          
6          
7          

Aby sprawdzić specyficzność działania inwertazy powtórz procedurę dla próbki nr 5 zastępując roztwór drożdży 500 µl śliny rozcieńczonej 1:10.

Bezpieczeństwo pracy

Przedstawione eksperymenty nie wymagają ani nie produkują żadnych niebezpiecznych związków poza HCl i NaOH. Podczas HCl, NaOH oraz śliny należy nałożyć rękawiczki ochronne.

Podczas odważania jodu należy zachować ostrożność i nosić maskę ochronną ponieważ jod łatwo sublimuje. Należy zachować szczególną ostrożność podczas podgrzewania probówek na palniku gazowym oraz podczas rozpuszczania śliny w ciepłym buforze.

Spodziewane wyniki

Ekstremalne warunki reakcji stworzone poprzez podgrzewanie i dodanie kwasu solnego uniemożliwiają hydrolizę skrobi oraz sacharozy. Jednak ani podgrzewanie ani dodatek kwasu działające oddzielnie nie dają tego efektu.

W warunkach łagodnych (bez podgrzewania i dodatku kwasu) ślina, jęczmień i ekstrakt drożdżowy hydrolizują swoje substraty. Zarówno podgrzewanie jak i dodatek kwasu zapobiegają hydrolizie: roztwory enzymów są zatem termo wrażliwe i wrażliwe na pH.

Dyskusja

Porównanie ekstremalnych warunków wymaganych przez katalizę chemiczną (wysoka temperatura, skrajne pH) z łagodnymi warunkami wymaganymi przez ekstrakty biologiczne, pozwala uczniom zapoznać się z ideą „specjalnej, mocnej substancji” obecnej w organizmach żywych, która jest wrażliwa na temperaturę, specyficzna (w odróżnieniu od katalizatorów nieorganicznych) i zdolna do katalizowania reakcji. W ten sposób uczniowie mogą odtworzyć historyczny rozwój wiedzy o enzymach, pojęcie enzymu nie będzie dla nich dłużej obce, ponieważ „słowa mogą mieć znaczenie tylko wtedy, gdy owo znaczenie ukształtowane zostało poprzez nasz osobisty stosunek do określanego przedmiotu lub zjawiska” (Dewey, 1910).

Podziękowania

Chciałabym podziękować profesorowi Umberto Mura z Department of Physiology and Biochemistry, University of Pisa za nieustającą zachętę. Specjalne podziękowania należą się profesor Rosannie Striccoli za korektę angielskiej wersji tekstu oraz moim studentom za ich cenne obserwacje, uwagi i wątpliwości.

Download

Download this article as a PDF

References

  • Dewey J (1910) How we think. Boston, MA, USA: D.C. Heath & Co
  • Payen A, Persoz JF (1833) Mémoire sur la diastase, les principaux produits de ses reactions et leur applications aux arts industriels. Annales de chimie et de physique 53: 73-92

Resources



License

CC-BY-NC-SA