Në zbulim të ADN-së

Përkthyer nga Eris Duro

Dean Madden pranë Qëndrës Kombëtare të Arsimimit në Bioteknologji, Universiteti i Reading, Mbretëri e Bashkuar, përshkruan zbulimin e ADN-së, dhe se si kjo mund të përftohet lehtësisht në laborator.

Johan Fridrih Misher

Më 1868, 24-vjecari Johan Fridrih Misher u zhvendos prej vendlindjes, Zvicrës, në Tubingen, Gjermani, për të studiuar në laboratorin e Ernst Feliks Hoppe-Seiler. Hoppe-Seiler ishte një biokimist nismëtar që përdori për herë të parë termin modern për pigmentin e kuq në gjak: hemoglobinë. Në bodrumin e kështjellës së Tubingenit, Misher punoi duke përdorur rruazat e bardha të gjakut (leukocite) nga fashot e marra prej spitalit atypranë. Pas shumë muajsh pune të lodhshme, ai arriti të izolonte një substancë acide të panjohur deri atëherë. Misher e quajti zbulimin e tij ‘nuklein’ sepse gjendej në nukleuset (bërthamat) e qelizave. Por kjo substacë ishte e papastër dhe Hoppe-Siler  këmbënguli të përsëriste eksperimentet vetë përpara botimit në revistën biokimike të sapothemeluar prej tij.

Pasi u kthye në qytetin e tij, Bazel, më 1870, Misher përsosi metodën dhe arriti të përftonte materialin bërthamor prej spermatozoidëve të salmonit, për të cilin, asokohe, Rini ishte i famshëm.  Si ato të leukociteve, bërthamat e spermatozoidëve janë krahasimisht të mëdha. Prej tyre, Misher izoloi nukleinë të pastër për herë të parë. Më 1889 një nxënës i tij, Ricard Altmann, na dha termin modern për nukleinën: acid nukleik. Prandaj, me 2003, u përkujtua jubileu i artë i heliksit të dyfishtë e jo '50 vjet ADN'.

Për një mësues shkence, një përshkrim i metodës së Misherit është interesant, mbi të gjitha për teknikat e thjeshta që u përdorën dhe ngjashmërinë me shumë prej procedurave që shpesh përdoren sot nëpër shkolla. Sidoqoftë, krahasuar me Misherin, mësuesit e sotëm e kanë më të lehtë. Në mungesë të frigoriferit, Misheri ishte i detyruar të fillonte punën në 5 të mëngjesit për tu siguruar që reagentët ishin të ftohtë sa duhej për të precipituar ADN-në, dhe ishte i detyruar të përgatiste enzimat proteazë prej stomakëve të derrave të sapotherur (Judson, 1996).

Laboratori ne Tubingen ku Misher përftoi nukleinën Prej Bibliotekës së Universitetit të Tubingenit, Tubingen, Gjermani

Protokollet në klasë

Përftimi i ADN-së prej materialeve të përditshme ka qenë një aktivitet i përhapur në laboratoret shkollore gjatë 20 viteve të shkuara. Edhe pse protokolle praktike të ngjashme ishin përshkruar më parë (psh Sands, 1970), ata nuk u përdorën, për shkak të ndërlikimit dhe natyrës së rrezikshme të disa prej reagentëve që nevojiteshin (Falconer & Hayes, 1986). Metoda më të thjeshta për izolimin e ADN-së u shfaqën për herë të parë në tekstet shkollore amerikane në mesin e viteve 1980. (psh Helms et al, 1986) dhe më vone hynë në projektet shkollore të bioteknologjisë (psh Rasmussen & Matheson, 1990). Në fillim të viteve ‘90, këto metoda kishin kaluar Atlantikun e botoheshin në anglisht e gjermanisht (Bayrhuber et al, 1990; NCBE, 1991). Me futjen e metodave të thjeshta e të lira, një ushtrim praktik për studentë universitarë mbërriti deri në klasat fillestare (Assinder, 1998).

ADN-ja nga qepa

Metoda më e përhapur (e, për arsye evidente, më popullorja) për përftimin e ADN-së kërkon veç qepë, detergjent shtëpiak e ujë me kripë. Seminaret praktike e botimet e Qendrës Kombëtare për Arsimimin në Bioteknologji (NCBE, 1991; 1993) mbështetën përhapjen e kësaj metode në Mbretërinë e Bashkuar. Mënyra më të sofistikuara për izolimin e ADN-së prej bizeleve të thata u përpiluan nga revista “Shkenca e Bimët për Shkollat” dhe qendra arsimore australiane “Makina e Gjelbër” – Green Machine – (NCBE, 2001). Por këto metoda përfshinin elektroforezën e ADN-së, prandaj u kufizuan tek nxënës të moshave më të mëdha.

Në kërkim të alternativave më të ëmbla se qepa, të shumtë ishin ata që sugjeruan zbatimin e ‘metodës së qepës’ tek disa fruta, psh kiëi, bananja dhe luleshtrydhet. Këto fruta japin përshtypjen e përftimit të sasive të mëdha të ADN-je, por në fakt produkti i izoluar është kryesisht pektin. Kjo mund të vërtetohet duke i shtuar preparatit enzimën pektinazë (pektina mund edhe të precipitohet në alkool – një hile e reçel-bërësve).

ADN-ja nga bizelet

Ky protokoll përdor bizele të ngrira. Kjo paraqet shumë përparësi krahasuar me metodën tradicionale të qepës. Në rradhë të parë, nuk nevojitet makinë grirëse për të shpërbërë indet bimore. Bizelet e shkrira mund të shtypen me lugë ose cilindër prej qelqi. Gjithashtu, bizelet mund të ruhen në frigorifer dhe të nxirren në sasitë që nevojiten. Për më tepër nuk duhet harruar se bizelet nuk bien erë! Izolimi i ADN-së (dhe ARN-së) zgjat 35 minuta, duke përfshirë kohën e inkubimit prej 15 minutash.

Përgatitja paraprake

Etanoli duhet të jetë i ftohtë. Vendoseni në një shishe plastike ne frigorifer të paktën 24 orë përpara se të filloni eksperimentin. Lexoni shënimin e mëposhtëm mbi sigurinë.

Materialet e instrumentet e nevojshme për cdo person/group

• Bizele, rreth 50 g (edhe bizelet e ngrira mund të përdoren nëse shkrihen paraprakisht)
• Detergjent shtëpiak, 10 ml (i lëngshëm e jo koncentrat)
• Kripë gjelle, 3 g
• Ujë i distiluar, 90 ml
• Etanol shumë i ftohtë, rreth 10 ml (edhe alkool industrial in shnatyruar është i përshtatshëm, por ju lutemi të lexoni shënimin mbi sigurinë në këtë faqe)
• Novozymes Neutrase (proteazë) 2-3 pika
• Akull, në një kanë me ujë të ftohtë
• Shiringë plastike 1 ml (pa gjilpërë)
• Letër filtëe për kafe (mos përdorni filtër laboratorik sepse lëngu kalon shumë ngadalë)
• Hinkë e madhe plastike
• 2 gota laboratorike 250 ml
• Epruvetë ose enë cilindrike e shkallëzuar
• Cilindër qelqi ose lugë për të trazuar përzierjen
• Enë me ujë 60°C

Procedura

1. Tresni kripën në 90 ml ujë të distiluar. Shtoni detergjentin e lëngshëm dhe përzjeni ngadalë.
2. Shtypni bizelet me cilindrin prej qelqi ose lugë. Shtoni bizelet e shtypura në gotën me detergjent, ujë e kripë.
3. Vendoseni gotën në enën në 60oC për 15 minuta. Ky trajtim shpërben vëmesat qelizore të bizeles.
   Detergjenti  formon komplekse rreth fosfolipideve të vëmesës dhe proteinave, duke i precipituar. Gjithashtu, jonet natrium prej kripës mbrojnë grupet fosfate  të ADN-së (të ngarkuara negativisht) – kështu molekulat e ADN-së bashkohen. Në 60°C, enzimat ADN-azë, të cilat mund të ndanin ADN-në, janë pjesërisht të shnatyruara.
4. Ftoheni përzierjen duke e vendosur gotën në një enë me ujë e akull për 5 minuta, duke përzjerë vazhdimisht.
   Kjo ngadalëson copëtimin e ADN-së, cka do të ndodhte nëse temperature e lartë do të qëndronte.
5. Filtrojeni përzjerjen në një gotë të dytë. Sigurohumni që shkuma në  pjesën e sipërme të lëngut të prekë materialin e filtruar.
   Ky i fundit përmban proteina të tretshme dhe ADN.
6. Fakultative: shtoni 2-3 pika proteazë në rreth 10 ml ekstrakt bizeleje në një epruvetë dhe përzjeni mirë.
   Proteaza do të shpërbëjë disa prej proteinave të preparatit.
7. Me shumë kujdes transferoni etanolin e ftohtë në anë të erpuvetës, për të formuar një shtresë në pjesën e sipërme të ekstraktit të bizeles.
8. Lëni epruvetën të qendrojë për disa minuta.
   Acidet nukleike (ARN e ADN) janë të patretshëm në etanol të ftohtë dhe precipitojnë në shtresën e sipërme.

Studime të mëtejshme

Një mjet për të nxjerrë ADN-në mund të përgatitet duke nxehur një pipetë Pasteri në flakë, e më pas duke përkulur majën përpara se qelqi të ftohet. Për elektroforezën e AND-së, tresni një pjesë në 0.5 ml bromofenol blu, më pas vendosni 20 ul në një pistë në xhel agarosë 1%. Pas elektroforezës, ngjyrosja me 0.04 % (masë/vëllim) solucion Azurë A do të evidenciojë acidet nukleike. ARN-ja merr ngjyrë më të lehtë rozë. (Madden, 2000).

Ndryshime të kësaj procedure mund të përdoren me elementë të tjerë ushqimorë, si psh spermatozoidë ose vezë peshku (Stromberg, 2001). Disa botime trajtojnë përdorimin e indeve limfatike të lopës, por përdorimi i tyre në shkolla është tashmë i pakëshillueshëm.

Siguria

Etanoli në frigoriferë

Sigurohuni që etanoli të jetë në një enë të mbyllur mirë. Përdorimi i frigoriferit mund të zevendësohet me vendosjen e një shisheje të mbyllur etanoli në akull disa orë para përdorimit.

Perdorimi i indeve të kafshëve

Që prej zbulimit të sëmundjes së lopës së cmendur në Britaninë e Madhe, autoritet Britanike të arsimit këshillojnë që të mos përdoren indet e lopëve, për arsye se ekziston një rrezik (edhe pse i vogël) i ekspozimit aksidentor ndaj agjentit infektiv gjatë procedurës.

Materialet

Shumica e materialeve të mësipërme mund të gjenden në supermarket.
Novozymes Neutrase mund të blihet në vëllime të vogla prej Qendrës Kombëtare për Arsimimin në Bioteknologji (Britani e Madhe).

Bibliografi

Assinder S (1998) Discovering DNA: 'The Recipe of Life'. Swindon, UK: Biotechnology and Biological Sciences Research Council

Bayrhuber H, Gliesche Ch, Lucius ER (1990) DNA-Isolierung mit einfachen Mitteln (Isolation of DNA using simple methods). Unterricht Biologie 14: 44

Delpech R, Madden D (2001) Working with DNA. In Topics in Safety (Third Edition) pp 99-105. Hatfield, UK: Association for Science Education

Falconer AC, Hayes LJ (1986) The extraction and partial purification of bacterial DNA as a practical exercise for GCE Advanced level students. Journal of Biological Education 20: 25-26

Helms D et al. (1986) Biology in the Laboratory. New York, NY, USA: WH Freeman & Co

Judson HF (1996) The Eighth Day of Creation: Makers of the Revolution in Biology. New York, NY. USA: Cold Spring Harbor Laboratory Press

Madden D (2000) Illuminating DNA. Reading, UK: National Centre for Biotechnology Education

NCBE (1991) DNA your onions? NCBE Newsletter Spring 1991

NCBE (1993) Practical Biotechnology. A Guide for Schools and Colleges. Reading, UK: National Centre for Biotechnology Education

NCBE (2001) Investigating Plant DNA. Reading, UK: National Centre for Biotechnology Education

Rasmussen AM, Matheson RH (1990) A Sourcebook of Biotechnology Activities. Reston, VA, USA: National Association of Biology Teachers

Sands MK (ed; 1970) Nuffield Advanced Science Laboratory Guide. London, UK: Longman

Strömberg E (2001) DNA from 'caviar'. Bioscience Explained 1(1)

Falenderime

Ky artikull u botua për herë të parë në School Science Review në mars 2003.