Individuele moleculen onder de microscoop Understand article

Vertaald door Dave Lommen. Zou het niet fascinerend zijn om individuele moleculen te kunnen bekijken en manipuleren? Patrick Theer en Marlene Rau van het Europees Moleculair Biologie Laboratorium leggen uit hoe je dit met een atomic force microscope voor elkaar krijgt. En het is zelfs mogelijk…

Figuur met dank aan
Henrik5000 / iStockphoto

Het idee om naar individuele moleculen te kijken houdt wetenschappers al meer dan honderd jaar bezig. Dit ambitieuze doel werd voor het eerst bereikt in 1981 met de ontdekking van de scanning tunneling microscope, wat in 1986 de Nobelprijs voor Natuurkunde opleverde voor Gerd Binnig en Heinrich Rohrer van het IBM Research Laboratory in Rüschlikon, Zwitserlandw1. Deze microscoop had echter flinke beperkingen: hij werkt alleen voor objecten die stroom begeleiden, waardoor veel (biomoleculaire) materialen niet bestudeerd konden worden. Binnig en zijn collega’s bleven zoeken naar betere oplossingen en presenteerden in 1986 de atomic force microscope (AFM), die voor zowel geleidende als niet-geleidende materialen gebruikt kan worden.

De naald wordt boven een
plaat van vinyl gehouden en
kan het oppervlak gaan
aftasten om geluid te
produceren.

Figuur met dank aan arbobo;
bron: Flickr

De werking van het instrument lijkt een beetje op die van een oude platenspeler, waarbij een scherpe naald een plaat van vinyl aftast om geluid te reproduceren (zie de figuur rechts). De AFM ‘voelt’de atomen meer dan dat hij ze ‘ziet’: de structuur van een oppervlak wordt afgetast met een zeer scherpe kegel (meestal gemaakt van silicium of siliciumnitride). Deze kegel zit vast aan een flexibele steun, die de kleinste details op het oppervlak kan volgen. Wanneer de punt, die uit een enkele atoom bestaat, dicht bij het oppervlak komt, wordt hij afgebogen door krachten tussen de twee. Dit kunnen allerlei soorten krachten zijn: mechanische, Vanderwaals, capillaire, chemische, elektrostatische, magnetische, Casimir of nog weer andere krachten, afhankelijk van het precieze materiaal.

Omdat de AFM deze verschillende krachten kan meten, is hij zeer veelzijdig, wat ertoe heeft geleid dat meer en meer wetenschappers het instrument zijn gaan gebruiken, met name in de materiaalwetenschappen en de biologie. De kracht die de afbuiging veroorzaakt is altijd miniem en evenredig met de afstand van de punt tot het oppervlak.

Hoe de afbuigingen van de
punt van de AFM vergroot en
gemeten worden. Klik op de
afbeelding om te vergroten

Figuur met dank aan Patrick
Theer

Hoe kan men deze minieme afbuigingen meten? De uitvinders gebruikten een slimme truc. Een laser schijnt op de top van de steun; vandaar wordt het laserlicht gereflecteerd naar een plaatsgevoelige lichtdetector. De verandering in de positie van de laserpunt op de detector (zie de figuur links, ∆H) als gevolg van een verbuiging van de steun (zie de figuur op pagina 61, ∆h) is evenredig met de afstand tussen de detector en de steun. Als de afstanden tussen de twee groot genoeg zijn, dan kunnen zelfs minieme afbuigingen gemeten worden. Dit maakt het mogelijk om de structuur van een oppervlak op atoomniveau te bestuderen.

Boten die last hebben van
biofouling

Figuur met dank aan
lovestruck; bron: Flickr

De toepassingen van de AFM zijn schier eindeloos. We bekijken er hier slechts een paar. Oorspronkelijk was de AFM ontwikkeld om de structuur van oppervlakken in het kleinste detail te observeren en analyseren. Dit is niet alleen wetenschappelijk interessant, maar kan ook directe economische voordelen hebben: biofouling is de ongewenste vervuiling door micro-organismen, planten, algen en/of dieren (zoals slakvissen of rankpootkreeften) op natte oppervlakken. Op scheepsrompen kan een hoog niveau van vervuiling de waterweerstand verhogen en daardoor de benzinekosten flink opvoeren, daarnaast is het een probleem in membraan-bioreactoren, koelwatersystemen van energiecentrales en sommige olieleidingen. Wetenschappers gebruiken de AFM om het niveau van biofouling vast te stellen om zo yr bepalen welk materiaal het best bestand is tegen deze biofouling (Finlay et al., 2010).

Figuur met dank aan Frantysek
/ iStockphoto

Op eenzelfde wijze heeft de AFM toepassingen in de landbouw: ananas-planten hebben vaak last van een schimmelziekte, fusariosis genaamd. Wetenschappers vergeleken de oppervlaktestructuur van cellen van ananas-culturen die resistent zijn tegen deze ziekte met culturen die er gevoelig voor zijn en ze vonden dat ze verschillende mechanische eigenschappen hebben. Dit kan nu gebruikt worden om resistente culturen te selecteren en te verbeteren, zodat ze de benodigde mechanische eigenschappen hebben (de Farias Viégas Aquije et al., 2010).

Is oppervlaktestructuur ook relevant voor de gezondheid van mensen? Jawel: in de tandartspraktijk wordt vaak gebruik gemaakt van de AFM, bij voorbeeld om verschillende methoden voor het verwijderen van plak of verkleuringen te vergelijken, om de ruwheid van de oppervlakken van beugels te meten en hoe dit hun effectiviteit beïnvloedt, of om de mate van erosie van tandglazuur door zuren in limonate te kwantificeren en om te testen hoe doeltreffend verschillende tandpasta’s zijn in het herstel van deze schade (Kimyai et al., 2011; Lee et al., 2010; Poggio et al., 2010).

De AFM heeft een hele
verzameling van
tand-gerelateerde
toepassingen

Figuur met dank aan webking /
iStockphoto

Een andere medische toepassing is de ontwikkeling van nieuwe biomaterialen in regeneratieve geneeskunde: hun oppervlakeigenschappen zoals ruwheid, oppervlakte-energie, oppervlakte-lading, chemische functionaliteit en samenstelling kunnen het gedrag van cellen waarmee ze in aanraking komen, beïnvloeden. Dus kan de AFM bijvoorbeeld gebruikt worden bij het ontwerp van biomaterialen die niet door het lichaam afgestoten worden en dus geschikt zijn voor medische implantaten zoals kunstmatige heupen (Al-Ahmad et al., 2010; Kolind et al., 2010; Padial-Molina et al., 2011).

Een ander groot toepassingsgebied van de AFM in de medische biologie is het misvouwen en samenstellen van eiwitten zoals α-synucleine, insuline, prionen, pancreashormoon en β-amyloide. Deze fenomenen zijn al sinds lang geassocieerd met degeneratieve ziekten zoals type II diabetes, Parkinson, BSE (‘gekke koeien-ziekte’), Huntington en Alzheimer. De AFM heeft hier al belangrijke informatie over de structuur op nanoschaal van deze aggregaten verschaft en men hoopt dat wetenschappers de AFM zullen kunnen gebruiken om te identificeren welke eiwitten misvouwen en hoe zij naastgelegen eitwitten stimuleren om deze onjuiste structuur te simuleren (Lyubchenko et al., 2010; voor een uitleg van het misvouwen van prionen, zie Tatalovic, 2010).

De European Synchrotron
Radiation Facility (ESRF) heeft
een atomic force microscope
ontwikkeld speciaal voor
gebruik in een Röntgen
-straal. Een mogelijke
toepassing is het precies
plaatsen van nanoschaal
objecten in een Röntgen
-straal. Dit is verre van
triviaal als zowel het object
als de Röntgen-straal 100
nm of minder in doorsnede
meten

Figuur met dank aan ESRF /
Small Infinity

Andere biologische interacties die onderzocht zijn met de AFM omvatten hoe menselijke trophoblasten (deze cellen vormen de buitenste laag van een blastocyste, welke voedingsstoffen verschaft aan het embryo, en ontwikkelen zich tot een groot deel van de placenta) interageren met epitheliale cellen van de baarmoeder – de basis voor een succesvol embryo-implantaat (Thie et al., 1998).

Het was maar een kleine stap van de AFM als analytisch apparaat tot AFM als apparaat waarmee atomen, moleculen of andere nanoschaal-structuren beïnvloed kunnen worden. Men kan bijvoorbeeld de punt als een nano-pincet gebruiken, waarmee heel precies gebieden van het plasma-membraan van een cel onderzocht kunnen worden, individuele eiwitlussen kunnen aan de kant gelegd worden om de structuur binnen een eiwit bloot te leggen en losse moleculen kunnen worden uitgerekt tot nieuwe structuren om hun elasticiteit te bepalen.

De volgende grote stap is het gebruik van de AFM voor nano-chirurgie: het introduceren of extraheren van individuele moleculen uit het cytoplasma van individuele cellen, om cellulaire homeostase te onderzoeken of voor het afleveren van medicijnen op een specifieke plaats binnenin een cel (Lamontagne et al., 2008; Müller et al., 2006).

Aangepaste AFM-punten kunnen ook gebruikt worden als boor of als pen: nano-malen verwijdert materialen in de vorm van lange gekrulde schilfers (Gozen & Ozdoganlar, 2010), terwijl bij dip-pen nanolithografie moleculaire of vloeibare ‘inkt’ zeer precies wordt afgeleverd. In de chemie en de levenswetenschappen wordt deze technologie gebruikt om nanoschaal sensoren te produceren of bij het etsen van metallische, halfgeleidende en metaaloxide nanostructuren, functionele nanocircuits of nano-apparatuur (Basnar & Willner, 2009). Dit, samen met het gebruik van de AFM om nanometer-grote deeltjes naar een bepaalde plaats te duwen, moet de weg vrijmaken voor de miniaturisatie van elektronische circuits en andere structuren.

Ondanks de eindeloze hoeveelheid toepassingen – dit waren slechts enkele voorbeelden – zijn de mogelijkheden van de AFM nog niet uitgeput. Toekomstige trends omvatten geoptimaliseerde punten en combinaties met andere technieken, bij voorbeeld om tegelijkertijd de oppervlakte-structuur en fluorescentie of elektrische eigenschappen te bepalen (Müller et al., 2006). Snelheid is een ander punt: er is recentelijk een AFM ontwikkeld waarmee biologische processen zoals chromosoom-replicatie en -scheiding, phagocytose en eiwitsynthese in real time kunnen worden vastgelegd, wel 1000 maal sneller dan voorheen mogelijk was (Ando et al., 2008).

Ben je nu klaar om je eigen toepassingen voor de AFM te bedenken? Dan wil je misschien Philippe Jeanjacquots instructiesw2 om je eigen instrument op school te bouwen volgen. Het is een lang project, maar samen met zijn studenten is het Philippe gelukt om een redelijk goedkope AFM te bouwen. Er is slechts één belangrijke voorwaarde: je moet een trillingsvrije ruimte, bijvoorbeeld een stille kelder, hebben om het apparaat op te zetten. Als je die kunt vinden, dan ben je slechts beperkt door je enthousiasme en vernuft.

Download

Download this article as a PDF

References

  • Al-Ahmad A et al. (2010) Biofilm formation and composition on different implant materials in vivo. Journal of biomedical materials research. Part B, Applied Biomaterials 95(1): 101-109. doi: 10.1002/jbm.b.31688
  • Ando T et al. (2008) High-speed AFM and nano-visualization of biomolecular processes. Pflügers Archiv: European journal of physiology 456(1): 211-225. doi: 10.1007/s00424-007-0406-0
  • Basnar B, Willner I (2009) Dip-pen-nanolithographic patterning of metallic, semiconductor, and metal oxide nanostructures on surfaces. Small 5(1): 28-44. doi: 10.1002/smll.200800583
  • de Farias Viégas Aquije GM et al. (2010) Cell wall alterations in the leaves of fusariosis-resistant and susceptible pineapple cultivars. Plant Cell Reports 29(10): 1109-1117. doi: 10.1007/s00299-010-0894-9
  • Finlay JA et al. (2010) Barnacle settlement and the adhesion of protein and diatom microfouling to xerogel films with varying surface energy and water wettability. Biofouling: The Journal of Bioadhesion and Biofilm Research 26(6): 657-666. doi: 10.1080/08927014.2010.506242
  • Gozen BA, Ozdoganlar OB (2010) A rotating-tip-based mechanical nano-manufacturing process: nanomilling. Nanoscale Research Letters 5(9): 1403-1407. doi: 10.1007/s11671-010-9653-7. Het volledige artikel is gratis on-line beschikbaar.
  • Kimyai S et al. (2011) Effect of three prophylaxis methods on surface roughness of giomer. Medicina Oral, Patología Oral y Cirugía Bucal 16(1): e110-e114. doi: 10.4317/medoral.16.e110. Het volledige artikel is gratis on-line beschikbaar.
  • Kolind K et al. (2010) A combinatorial screening of human fibroblast responses on micro-structured surfaces. Biomaterials 31(35): 9182-9191. doi: 10.1016/j.biomaterials.2010.08.048
  • Lamontagne CA, Cuerrier CM, Grandbois M (2008) AFM as a tool to probe and manipulate cellular processes. Pflügers Archiv: European journal of physiology 456(1): 61-70. doi: 10.1007/s00424-007-0414-0
  • Lee GJ et al. (2010) A quantitative AFM analysis of nano-scale surface roughness in various orthodontic brackets. Micron 41(7): 775-782. doi: 10.1016/j.micron.2010.05.013
  • Lyubchenko YL et al. (2010) Nanoimaging for protein misfolding diseases. Wiley Interdisciplinary Reviews (WIREs). Nanomedicine and Nanobiotechnology 2(5): 526-543. doi: 10.1002/wnan.102
  • Müller DJ et al. (2006) Single-molecule studies of membrane proteins. Current Opinion in Structural Biology 16(4): 489-495. doi: 10.1016/j.sbi.2006.06.001
  • Padial-Molina M et al. (2011) Role of wettability and nanoroughness on interactions between osteoblast and modified silicon surfaces. Acta biomaterialia 7(2): 771-778. doi: 10.1016/j.actbio.2010.08.024
  • Poggio C et al. (2010) Impact of two toothpastes on repairing enamel erosion produced by a soft drink: an AFM in vitro study. Journal of Dentistry 38(11): 868-874. doi: 10.1016/j.jdent.2010.07.010
  • Tatalovic M (2010) Deadly proteins: prions. Science in School 15: 50-54. www.scienceinschool.org/2010/issue15/prions
  • Thie M et al. (1998) Interactions between trophoblast and uterine epithelium: monitoring of adhesive forces. Human Reproduction 13(11): 3211-3219. doi: 10.1093/humrep/13.11.3211. Het volledige artikel is gratis on-line beschikbaar.

Web References

  • w1 – Om meer te weten te komen over de ontdekking van de scanning tunnelling microscoop, die Gerd Binnig en Heinrich Rohrer de Nobelprijs voor Natuurkunde opleverde, zie: http://nobelprize.org/nobel_prizes/physics/laureates/1986
  • w2 – Om de instructies voor het bouwen van je eigen AFM op school te downloaden, zie hier.

Resources

Author(s)

Dr. Patrick Theer is een natuurkundige die het grootste deel van zijn carrière aan microscopie-technieken gewerkt heeft. Na een studie medische fysica in Berlijn (Duitsland), Toronto (Canada) en Guildford (Verenigd Koninkrijk), vertrok hij naar de Universiteit van Heidelberg in Duitsland. Daar voltooide hij een promotie in het gebied van de non-lineaire optica. Hij bestudeerde hiervoor de beelddiepte-limiet in twee foton-microscopie – en optische selectiemethode die informatie kan verschaffen uit zeer diepe lagen van verstrooiende weefsels. Dr. Theer deed postdoctoraal werk aan de Universiteit van Washington in Seattle (Verenigde Staten), waar hij spanningsgevoelige verfstoffen onderzocht aan de hand van tweede harmonische generatie-microscopie. Momenteel werkt hij als senior research assistant aan het Europees Moleculair Biologie Laboratorium in Heidelberg, waar hij aan een licht-vel-gebaseerde fluorescentie-microscoop voor de studie van embryonale ontwikkeling werkt.

Dr. Marlene Rau is geboren in Duitsland en opgegroeid in Spanje. Na een promotie in de ontwikkelingsbiologie aan het Europees Moleculair Biologie Laboratorium studeerde zij journalistiek en begaf ze zich in het veld van de wetenschapscommunicatie. Sinds 2008 is zij een van de redacteuren van Science in School.


Review

Dit artikel is geschikt voor een breed scala aan wetenschapslessen – niet alleen in de natuurkunde, maar ook bijvoorbeeld wanneer de fysiologie van dieren of biomedische wetenschappen besproken worden. Scholieren kunnen verder onderzoek doen aan de atomic force microscope en zijn toepassingen, want er zijn diverse materialen beschikbaar op het Internet over de voor- en nadelen van verschillende microscopie-technieken. Ze kunnen ook de groep wetenschappers die de AFM hebben uitgevonden opzoeken (de wetenschappers kregen al een Nobelprijs voor eerder onderzoek) en meer over hen en hun werk te weten komen.

Potentiële begripsvragen zijn bijvoorbeeld:

  1. Wat was de limitatie van de scanning tunnelling microscope?
  2. Welke microscoop was ontwikkeld om de beperkingen van de scanning tunnelling microscope te overwinnen?
  3. Leg uit hoe de AFM vergeleken kan worden met een platenspeler (houd er rekening mee dat sommige leerlingen niet meer bekend zijn met oude platenspelers).
  4. Leg de term biofouling uit.
  5. Waarom is biofouling een probleem?
  6. Geef voorbeelden van mogelijke toepassingen van de AFM.
  7. Wat zou je willen onderzoeken als je zelf een AFM zou hebben?

Dit artikel kan gebruikt worden met groepen meer gevorderde leerlingen of leerlingen die creatief kunnen denken, bijvoorbeeld voor een uitgebreide scriptie in combinatie met de film Honey I Shrunk the Kids (over een wetenschapper die werkt aan een top-secret machine die objecten en – per ongeluk – mensen verkleind), om de leerlingen te laten nadenken over het kijken naar individuele moleculen. Waar zouden zij de AFM voor willen gebruiken? Zouden ze hun plaatjes gebruiken als kunst of voor wetenschappelijk onderzoek? Zouden ze hun kennis willen gebruiken om ziektes te genezen of om te zien hoe mooi de wetenschap op dit niveau kan zijn?


Jennie Hargreaves, Verenigd Koninkrijk




License

CC-BY-NC-ND