Üreazın etkisinin incelenmesi

Enzimler, bütün canlıların metabolizmasında önemli rol oynar. Genetik bilginin kopyalanmasından (DNA polimeraz), sindirime kadar vücudumuzdaki birçok biyokimyasal tepkimeyi katalize ve kontrol ederler. Ne var ki, enzim etkisini gösterebilmek her zaman kolay değildir. Bu, sınıfta enzim etkisini öğretmeye yardımcı olacak basit, ucuz ve kolay bir protokoldür. Gereken bütün malzemeler kolay bulunabilir ve güvenlidir.

Bu çalışmada, soya fasulyesindeki (Glycine max) üreaz enzimi, üreyi ammonyak ve karbon diokside yıkar:

CO(NH₂)₂ + H₂O → 2 NH₃ + CO₂

Kırmızı lahanadan elde edilen basit bir pH göstergesiyle saptanabilecek olan yüksek bir pH’ya sahiptir amonyak (NH₃) solusyonu. Reaksiyon sonrası oluşan amonyak, kokuyla da saptanabilir.

Üreaz birçok farklı canlı tarafından üretildiğinden, bu pratik etkinlik aşağıdaki derslerde de kullanılabilir:

• Azot siklusu
• Canlıların çevreleri üzerine etkileri
• Hayvanların farklı diyetlere uyum sağlaması.

Protokole Hazırlık

Üre nedir?

Nükleik asitler ve proteinler, her canlı tarafından azotsal atıklar oluşturarak ayrıştırılırlar. Memeliler, amfibianlar ve bazı omurgasızlar azotsal bir atık olan üreyi, karaciğerlerinde üretirler. Üre, nitrojenin özellikle iyi yerleştiği bir bileşiktir çünkü suda çözünür ve balıkların artık ürünü olan amonyaktan daha az toksiktir. İnsan idrarı %2 üre içerir.

Üre ilk sentez edilen organik bileşiktir. Friedrich Wöhler, 1828'de üreyi inorganik bileşiklerden (kurşun siyanat ve ammonyum hidroksid) sentez etmişti. Bu bir dönüm noktasıydı çünkü o zamana kadar, sadece canlı organizmaların organik bileşikleri yapabileceğine inanılırdı. Bu bileşiklerin özel olduğu ve onları yapmak için hayati güce ihtiyaç olduğu düşünülürdü. Wöhler, canlı ve cansız dünya arasındaki boşluğa bir köprü kurmuştur.O zamanlarda Nobel ödülü olmadığı için , bu buluşu için Nobel ödülü alamamıştır. Günümüzde çok sayıda sentez edilen üre, plastik yapımında ve ucuz azotsal gübre olarak kullanılmaktadır.

Üreaz nedir?

Üreaz, ürenin karbon dioksid ve ammonyağa hidrolizini katalize eder. Başlıca, tohumlarda, mikro-organizmalarda ve omurgasızlarda bulunur. Bitkilerdeki üreaz, hekzamerdir (6 eş zincirden oluşur) ve sitoplazmaya yerleşmiştir. Bakterilerde, iki veya üç farklı alt birimden oluşur. Üreazın, harekete geçebilmesi için her alt birimi için iki nikel iyonuna bağlanması gerekir.

Üreaz nasıl ünlü oldu?

James B. Summer, 1926'da birçok bilim adamının enzimleri kristalize etmenin imkansız olduğunu düşündüğü zamanlarda, jackbean (Canavalia ensiformis)'den üreazı ilk kez bir enzim olarak saflaştırmış ve kristalize etmişti. Bu, Sumner'a 1946'da kimya dalında Nobel ödülünü kazandırmıştır. Günümüzde, proteinlerin kristalize edilmesi, bilim adamlarının yapılarını keşfetmelerine ve nasıl çalıştıklarını saptamalarına yardımcı olur. Bu tür bilgiler, HIV enzimlerinin etkisini engellemek veya kuduz tedavisine yönelik olası gelişmelere yardımcı olmak için enzimi etkileyen maddelerin tasarlanmasına fırsat verir (Ainsworth, 2008).

Soya fasülyelerinde neden üre bulunur?

Soya fasülyelerindeki üreazın rolü çok açık olmamakla birlikte tahmin edilebilirdir. Soya yapraklarında bulunan üreaz, fasülyesindekine göre bin kat daha zayıftır. Yaprak enzimi proteinlerden nitrojeni geri dönüştürür ( proteinler, üreye ayrışır). Fasülyelerde de, filizlenme döneminde enzim aynısını yapar. Ortaya çıkan amonyak, bitki hücrelerini ayrıca patojenlerden de korumaktadır, enzimin kendisinin böcek öldürücü özelliği var görünmektedir.

Üreaz başka nerelerde bulunur?

Mide ülserlerinden sorumlu Helicobacter pylori gibi birçok bakteri türü üreaz üretir. H. pylori, çoğalması için en uygun olan mide asidite pHsını, 3'ten 7'ye üreaz sayesinde artırır. H. pylori için olan ticari testler, nefeste üreaz varlığını gösterirler ve mide ülserlerinde tanı aracı olarak kullanılırlar.

İnekler ve koyunlar gibi geviş getiricilerin diyetlerindeki bitkileri sindirmelerine yardımcı olan sellüloz sindiren bakteriler, midelerinin ilk bölümü olan rumende yer alır. Geviş getiriciler, midelerinin bu bölümünde ortama üre salarlar, bu da bakteriyel çoğalma için mükemmel bir azot kaynağı oluşturur. Bakteriler de, üreyi yıkıp azotu alabilmek için üreaz üretirler. Sonunda, hayvanlar bakteriyel kütleyi sindirirler.

Soya fasulyelerindeki üreaz insanlara zararlı mıdır?

Üreaz zararsızdır. Bunula birlikte, taze soya fasulyeleri, sağlıksız başka bileşikler içerir. Taze soya fasulyelerinde tripsin enzimini inhibe eden bir protein olduğu için yenmeye elverişli değildir. İnhibitörün, varlığını tespit etmek kolay değildir, fakat üreaz gibi ısıyla inaktive olur ve ikisinin de, ısı intolerans dereceleri benzerdir. Bu nedenle, inhibitörün inaktive olduğundan emin olmak için soya fasulyesinden hazırlanan soya unu, tempe ve tofu gibi besinler, burada anlatılana benzer şekilde üreaz aktivitesi yönünden test edilebilirler. Eğer üreaz aktivitesi saptanamazsa, inhibitörün de inaktive olduğu varsayılabilir.

Azot döngüsünde üreaz

Nitrojen, bitkilerin büyümesinde çok önemlidir, fakat birçok bitki onu sadece amonyum ya da nitrat formunda kullanabilir. Sadece baklagiller (simbiyozla yaşadıkları bakteriler sayesinde) ve siyanobakteriler, havadaki element nitrojeni kullanabilirler.

Çoğu hayvan, idrarla üre atarlar. Hayvan idrarıyla beslenen toprak mikro-organizmaları, bitkilerin kullanımı için üreyi amonyağa çeviren üreazı salgılarlar. Bu nitrojen döngüsünün bir parçasıdır. Proteinler ve diğer bileşiklerden gelen nitrojen devamlı bir döngü içindedir.

Yöntem

Bu yöntem, öğrencilere tohumlardaki bitki enzim aktivitesini saptamalarına yardımcı olur. Substrat (üre) varlığında, üreaz onu karbondioksit ve amonyağa parçalar. Suda eriyen amonyak pH’I yükseltir ve mor lahana pH indikatöründe görüldüğü gibi bir etki oluşur. Öğrenciler, deneyde ürün (amonyak) elde edebilmek için, hem substrat (üre), hem de enzimin (üreaz) gerekli olduğunu öğrenirler. Enzim aktivitesinin pH’ı yükselttiğini gözlemlerler.

Mor lahana özütü-önemli bir pH indikatörü

Bu yöntemde, pH indikatörü olarak mor lahana özütü kullanırız. İçinde antosiyaninler bulunur. Bu bileşiklerin solusyondaki yapı ve rengi pH duyarlıdır. Solusyon, pH 7'de mor/mavi renkliyken, asidik ortamda rengi kırmızıya döner. Solusyon, pH 7'nin üstüne çıkıp daha alkalin hale geldiğinde rengi yeşile döner. Bu renk değişiklikleri geri dönüşümlüdür. Sitrik asit ve kabartma tozunu (sodyum bikarbonat)I arka arkaya eklediğinizde neler oluyor kontrol edin.

Araçlar ve gereçler

Her öğrenci veya öğrenci grubu için:

• 20 ml %10'luk üre gübresi (saf üreden oluşan katı gübre)
• 5 ml %10'luk sitrik asit solusyonu (veya düşük pH'lı başka bir solusyon)
• 5 ml %10'luk sodyum bikarbonat solusyonu (NaHCO₃) ( veya yüksek pH'lı başka bir solusyon)
• 40 ml mor lahana indikatörü, aşağıda tarif edildiği gibi hazırlanmış
• 10 ml soya fasulyesi özütü, aşağıda tarif edildiği gibi hazırlanmış (kurutulmuş soya fasulyesinin 1 gramından)
• 10 ml distile su
• Solusyonları aktarmak için Pastör pipeti ya da plastik içme pipeti
• 6 test tübü ve test tüp rafı

Soya özütü ve mor lahana indikatörü hazırlanırken, blender, kanamış su, filtre kahve kağıdı ve huniye ihtiyaç duyulur.

Zamanlama

Deney 30 dakika içinde tamamlanabilir.

Soya fasülyesi süspansiyonu ve mor lahana özütü önceden yapılabilir ya da hazırlanışı ders sırasında gösterilebilir. Bu sadece on dakikayı alır, ama fasülyeler dersten en az 1 saat önce mutlaka suda bekletilmelidir.

Soya üreazıyla üre arasındaki bu reaksiyon yaklaşık 10 dakikayı alır.

Hazırlanışı

Mor lahana indikatörü

1. Mor lahana yapraklarını çubuklar şeklinde kesin ve ısıya dayanıklı bir kabın içine koyun. Yaprakları tamamen örtecek şekilde üzerine 200 ml kaynamış sıcak su dökün.
2. Beş dakika sonra, suyu süzün ve soğumaya bırakın.
3. Yaprakları atın.

Üreaz içeren soya fasulyesi özütü

1. Soya fasulyelerini en az 1 saat suda bekletin (tercihen bir gece önceden).
2. Parçalayıcıda 1 gr kuru soyaya 10 ml su eklenerek (fasülyelerin bekletildiği su da kullanılabilir) karışım tamamen pürüzsüz olana kadar parçalanır (yaklaşık 5 dakika).
3. Huni içindeki filtre kağıdı aracılığıyla soya püresini süzün.
4. Üreaz içeren sıvıyı biriktirin ve saklayın

İnceleme

Aşağıda verilen hacimler, standart cam tüpleri (~10 ml) içindir.

En başta öğrencilere pH'ın mor lahana özütünün rengini nasıl etkilediğini sorun.

1. Üç tübün her birine 3 ml mor lahana indikatörü damlatın.
2. İlk test tübüne 2 damla sitrik asit solusyonu damlatın. Karıştırıp, renk değişikliğini gözlemleyin. Her içeriği ekledikten sonra pipeti suyla durulayın.
3. İkinci test tübüne 2 damla sodyum bikarbonat ekleyin. Karıştırıp, renk değişimini gözlemleyin.
4. Üçüncü test tübüne 2 damla distile su ekleyin. Karıştırıp, renk değişimini gözlemleyin.
5. Her üç test tübündeki solusyonların renklerini karşılaştırıp not edin. Referans olarak tüpleri bir kenara koyun.

Daha sonra, soya fasülyelerinden elde edilen üreazın etkisini inceleyin.

1. Üç yeni test tübünün her birine 2 ml mor lahana indikatörü ekleyin.
2. Tüplerin ikisinin her birine 2 ml üre solusyonu karıştırın. Rengi not edin.
3. Geri kalan tübe ve üre solusyonu koyulan tüplerden birine 2 ml soya süspansiyonu ekleyin.
4. Bütün tüplerdeki karışımların kokularını ve renklerini karşılaştırın. Bu gözlemi 3 dakika sonra yeniden tekrarlayın.

Yorumlama

Mor lahana indikatörü artan pH'la birlikte yeşile döner. Amonyak kokusuyla birlikte bu renk değişikliği, enzim ve substratın her ikisinin de olduğu tüpte saptanabilir. Sadece enzim ya da substrat içeren tüplerde pH sabit kaldığı mor lahana indikatörü mor renkte kalır.

Güvenlik

Çocukların yaklaşık %1'i soya fasülyesi özütüne allerjiktir (bakınız McGee, 2004). Öğretmenlerin, bu protokolü uygulamadan önce öğrencilerinin hiç birinde böyle birşey olup olmadığını kontrol etmesi önerilir.

İleri incelemeler

Enzim aktivitesini etkileyen (ısı, pH ve enzim, substrat ve ürün konsantrasyonu gibi) faktörleri incelemek için takip eden bir deney planlanabilir.

Teşekkür

Bu basit protokol, Avrupa Komisyonunun 6. Çerçeve Programı tarafından desteklenen Volvox projesi için Anna Lorenc tarafından oluşturulmuştur.