Czy umiałbyś znaleźć mutację powodującą nowotwór?

Wszystkie nowotwory spowodowane są zmianami sekwencji DNA w niektórych komórkach naszego ciała. Jak powstają takie zmiany? Materiał genetyczny narażony jest na różne mutageny np. promieniowanie UV, które są w stanie zmienić (zmutować) nasze DNA. Błędy te akumulują się w organizmie poprzez proces replikacji, poprzedzający podział komórki. Czasem zdarza się, że mutacja nastąpi w sekwencji bardzo ważnego genu, zmieniając jego funkcję np. przyspieszając wzrost i podział tej komórki i komórek potomnych. Komórki z tą mutacją rosną i dzielą się szybciej niż komórki sąsiednie (bez mutacji).

Z upływem czasu kolejne mutacje w DNA mogą uszkodzić funkcję innego ważnego genu, powodując powstanie wyjątkowo szybko rosnących i inwazyjnych komórek. Prowadzi to do szybkiego nagromadzenia się komórek - powstania nowotworu. Nowotwór może zaatakować otaczające tkanki a czasem i „przerzucić” się na inne części ciała.

Geny, których mutacje powodują rozwój nowotworów nazywamy genami nowotworowymi.

Antyonkogeny (geny supresorowe; z ang. Tumor suppressor genes, TSGs; Rysunek 1) kodują białka spowolniające wzrost komórki i zapobiegające zbyt szybkim podziałom oraz przyspieszające apoptozę (zaprogramowaną śmierć komórki), gdy DNA zostało poważnie uszkodzone. Jeśli w danej komórce obie kopie (allele) TSG ulegną mutacji, komórka ta traci kontrolę nad swoim podziałem. Gdy tylko jeden allel jest uszkodzony, drugi wciąż jest w stanie zahamować nadmierny wzrost komórki.

Protoonkogeny (Rysunek 2) natomiast kodują białka promujące podział i różnicowanie się (specjalizację) komórki. Mutacja w protoonkogenie, sprawiająca, że kodowane przez ten gen białko jest czynne biologicznie cały czas lub że aktywność tego genu nie jest prawidłowo regulowana, przekształci ten gen w onkogen, promujący niekontrolowany wzrost i podział komórki. Mutacja tylko jednej kopi protoonkogenu jest wystarczająca by rozpocząć rozwój nowotworu (porównaj z antyonkogenem; przyp. tłum).

Każda choroba nowotworowa jest spowodowana unikalną mieszanką mutacji w protoonkogenach i/lub TSGs. Zakłada się, że potrzebne jest 5 lub więcej mutacji w genach nowotworowych w danej komórce (i jej komórkach potomnych), by rozwinął się nowotwór.

KRAS (wymawia się kej-rass) jest protoonkogenem kodującym białko KRAS – wewnątrzkomórkowe białko sygnalizacyjne zaangażowane w proces wzrostu komórki (by rozróżnić nazwę genu od nazwy białka, nazwy genu pisane są kursywą). Zaproponowane niżej ćwiczenie zawiera oryginalne sekwencje genomowe z bazydanych Cancer Genome Project^w1. Uczniowie mają za zadanie porównać je ze sobą w celu identyfikacji mutacji w genie KRAS wywołujących rozwój nowotworu min. trzustki, jelita grubego czy płuc. Oryginalnie, ćwiczenie to zostało zaprojektowane dla uczniów odwiedzających Sanger Institute^w2. Obecnie jest ono również dostępne na stronie internetowej Yourgenome.org^w3. Dodatkowo ćwiczenie to stanowi wprowadzającą część kursu bioinformatycznego dla nauczycieli organizowanego przez ELLS^w4 przy European Bioinformatics Institute^w5 w Hinxton (Wielka Brytania). Ćwiczenie to ma na celu pobudzić do dyskusji na temat nowotworów, znaczenia mutacji genetycznych oraz struktury i funkcji białek.

Ćwiczenie - mutacje KRAS

Czas ćwiczenia ok. 45-60 minut (z prezentacją i dyskusją)

Materiały

Wszystkie materiały potrzebne do wykonania tego ćwiczenia dostępne są bezpłatnie na stronie internetowej Yourgenome.org w formie pojedynczych plików lub w skompresowanej formie pliku zip^w6. Do wykonania tego ćwiczenia potrzebne są.

• Zestaw 11 arkuszy (stron) (KRAS_student_wsheet.pdf) – każdy przedstawia 2 fragmenty sekwencji normalnego i zmutowanego genu. Jeden arkusz przypada na parę uczniów (11 par uczniów). Zestaw ten dostępny jest również w wersji czarno białej oraz wersji dostosowanej do uczniów z daltonizmem. Dla grup większych niż 20 osób potrzebne są 2 zestawy arkuszy po 11 stron.

• Jeden duży plakat z sekwencją genu (tylko egzony; KRAS) (KRAS_gene_banner.pdf) dla całej klasy oraz małe (A4 lub A3) wydruki sekwencji genu KRAS (KRAS_genesheet_yg.pdf; Rysunek 3) dla każdej z grup. Plakat sekwencji genu należy przygotować sklejając poszczególne kartki A4 z fragmentami sekwencji genu w odpowiedniej kolejności. Na plakacie tym należy zaznaczyć ostateczne wyniki analizy uczniów.
• Koło lub tabelka z kodonami reprezentującymi kodowane przez nie aminokwasy (KRAS_codon_wheel.pdf dla każdej z grup (zobacz rysunek 4 i 5)
• Tabelka sumująca wyniki dla każdej z grup (KRAS_ data_sheet.pdf)
• Długopisy

Aby na dużym plakacie sekwencji genu KRAS zaznaczyć spostrzeżone mutacje potrzebne będą strzałki, a do zaznaczenia, które regiony genu zostały już sprawdzone przez uczniów potrzebne będą kwadraty (zobacz KRAS_annotations.pdf). Do zamocowania strzałek i kwadratów potrzebna będzie np. plastelina czy Blu Tack. Dokładne wskazówki, jak przeprowadzić to ćwiczenie dostępne są online^w6.

Dodatkowo pomocne do wykonania tego ćwiczenia mogą być modele DNA, białek czy aminokwasów, jak również animacje Wellcome Trust Sanger Institute na temat nowotworów (Rogue cells and Role of cancer genes) dostępne na stronie internetowej ćwiczenia dotyczącego genu KRAS^w6.

Wprowadzenie do ćwiczenia

Prezentacja Investigating Cancer (z ang. Badanie nowotworów; dostępna w internecie^w6) wprowadzi uczniów w tematykę nowotworów (raka). Przedstawia ona jak powstaje nowotwór - poprzez zmianę w sekwencji DNA, wyjaśnia różne powody zachodzenia mutacji oraz objaśnia materiały, które potrzebne są do przeprowadzenia tego ćwiczenia. Dodatkowo, wiele aspektów przedstawionych w tej prezentacji ma na celu zachęcić do dyskusji na temat nowotworów (zobacz uwagi do prezentacji^w6).

W pierwszej części ćwiczenia, uczniowie porównują fragmenty sekwencji genu KRAS ze zdrowej i ze zmutowanej komórki. Znalezione różnice powinni zaznaczyć na przydzielonych wcześniej arkuszach oraz na dużym plakacie genu.

Na każdym z arkuszy przedstawiona jest oryginalna analiza (fragmenty analizy) sekwencjonowania DNA genu KRAS przeprowadzona ze zdrowej i nowotworowej próbki biologicznej. Analiza ta – wykres - składa się z 4 linii. Każda linia jest innego koloru i reprezentuje jedną z 4 zasad, a każdy pik na danej linii reprezentują miejsce występowania poszczególnej zasady w sekwencji:

Czerwona: T

Zielona: A

Niebieska: C

Czarna: G (normalnie linia ta jest żółta, ale by łatwiej było ją widać zastąpiona została czarną)

11 arkuszy zostało przygotowanych dla 11 par uczniów. Na każdym z nich przedstawione są dwa różne regiony (fragmenty) genu KRAS. Na arkuszach od 1 do 6 znajduje się 6 mutacji – proszę zwrócić uwagę, że arkusze powinny zostać dobrze wymieszane zanim zostaną rozdane uczniom i że wszystkie arkusze powinny zostać przeanalizowane by cała sekwencja genu została sprawdzona. Należy tu zwrócić uwagę uczniów na fakt, że mutacje są stosunkowo rzadkie i dlatego nie każda para uczniów znajdzie ją na swoim arkuszu. Będzie do dobrym wstępem do dyskusji na temat istotności negatywnych wyników oraz roli szczegółowych analiz w badaniach naukowych.

Jak znaleźć mutacje?

Używając objaśnionych wyżej arkuszy uczniowie mają za zadnie porównać sekwencje DNA genu KRAS ze zdrowej i zmutowanej komórki tego samego pacjenta. Najłatwiej będzie to zrobić podpisując pod każdym pikiem wykresu odpowiednią zasadę (każdy kolor reprezentuje inna zasadę, legenda kolorów znajduje się w prawym górnym rogu na każdym arkuszu) a następnie porównać obie (zdrową i zmutowaną) sekwencje.

Jeśli jedna z liter pomiędzy sekwencjami jest inna – kolor piku jest inny – oznacza to, że w tym miejscu zaszła mutacja. Popatrzmy na rysunek nr. 7, A w sekwencji zdrowej komórki zostało zamienione (czerwona strzałka) na G w komórce zmutowanej.

Jeśli uczniowie zauważą podwójny pik w miejscu pojedynczej zasady – dwie linie różnego koloru, jedna pod druga - obie zasady, reprezentowane przez te dwa kolory, powinny być zanotowane. Popatrzmy na rysunek nr. 8, sekwencja zdrowej komórki zawiera G (czerwona strzałka), podczas gdy w sekwencji nowotworowej mamy G i C. Nie jest to jednak wynikiem insercji dodatkowej zasady. Oznacza to, że zaszła mutacja tylko jednego z dwóch allelów genu – w jednym allelu pozostaje G a w drugim G zamienione jest na C.

Przeanalizowane sekwencje genu najlepiej zaznaczyć haczykiem by nie pomylić się w dalszej analizie (zobacz rysunek 9, po lewej stronie).

Znalezione mutacje najlepiej zaznaczyć biorąc w kółko zmienioną zasadę razem z numerem kodonu, w której zasada ta występuje (zobacz rysunek 9: G w kodonie 12).

Znalezione mutacje powinny być zapisane w tabelce znajdującej się w dolnej części arkuszu. Za pomocą koła z kodonami należy przetłumaczyć kodony na aminokwasy i wpisać do tabelki jak pokazane na przykładzie w tabelce nr. 1:

Po znalezieniu wszystkich mutacji, należy zsumować je w tabelce nr. 2 - sumującej wyniki.

Omawianie wyników

Uzyskane wyniki reprezentują podstawienia pojedynczych zasad w sekwencji. Mutacje te występują w kodującej sekwencji genu KRAS i możemy je podzielić na 3 rodzaje, w zależności od tego, jaki posiadają efekt.

• Mutacje synonimiczne – mimo mutacji, kodon koduje ten sam aminokwas jak jego niezmutowana forma.
• Mutacje niesynonimiczne - zmutowany kodon koduje inny aminokwas.
• Mutacje nonsensowne – zmutowany kodon koduje sygnał STOP i hamuje dalszą syntezę białka.

Uczniowie powinni przedyskutować, czy znalezione mutacje są znaczące – czy wpływają na funkcję białka czy są mutacjami milczącymi? Np. mutacje kodonów 30 i 173 są milczące i nie zmieniają one funkcji i/czy struktury białka.

Wspomniana wyżej prezentacja na temat mutacji genu KRAS zawiera również trójwymiarową rekonstrukcję struktury białka KRAS (Rysunek 10). Na slajdach 26-30 widzimy, że wszystkie znaczące mutacje tego genu kumulują się w tym samym regionie białka. Pierwszymi odkrytymi mutacjami białka KRAS powodującymi powstawanie nowotworu były mutacje kodonów 12,13 i 61. Mutacja w kodonie 146 odkryta została stosunkowo niedawno, w roku 2005. Slajdy te mogą być przydatne do dyskusji na temat, jak mutacje te mogą wpłynąć na strukturę białka KRAS i jego rolę w regulacji wzrostu komórki.

Dodatkowym ćwiczeniem dla uczniów może być modelowanie struktury białka KRAS poprzez zaznaczanie mutacji w odpowiednich aminokwasach. Potrzeby będzie to tego program komputerowy RasMol. Więcej informacji na ten temat znajduje się w załączniku dla nauczycieli^w6.

Jak wykorzystać dane z analiz genetycznych do walki z nowotworami?

W materiałach informacyjnych dla nauczycieli^w6 znajduje się wiele informacji wprowadzających w tematykę nowotworu. Należy zwrócić uwagę uczniów, że KRAS służy tu, jako przykład i jest jednym z wielu genów nowotworowych. Ćwiczenie to ma na celu zachęcić uczniów do dyskusji na temat jak analizy genetyczne mogę pomóc w zrozumieniu jak powstają nowotwory oraz jak planować terapie nowotworowe. Poniżej znajdują się przykładowe pytania do rozpoczęcia dyskusji:

• Jakie eksperymenty i jakie metody mogłyby być pomocne by stwierdzić, które nowotwory spowodowane są mutacjami w genie KRAS?
• W jaki sposób informacje te można by dalej wykorzystać?
• Nowotwór jest chorobą genetyczną: powstaje poprzez zmianę sekwencji DNA. Wiele ludzi uważa, że finansowanie genetycznych badań naukowych nad nowotworem jest jedynym i najlepszym sposobem umożliwiającym rozwój terapii nowotworowych. Jednak aplikacja terapii nowotworowych oraz opieka nad pacjentami również wymaga inwestycji ogromnej ilości pieniędzy (brytyjski system zdrowotny wydał ponad 2 biliony £ w roku 2000 samą opiekę pacjentów). Jaki podział pieniędzy zaproponowaliby uczniowie?