Scoprire il DNA

Nel 1868 il ventiquattrenne Johann Friedrich Miescher si trasferì dalla nativa Svizzera a Tubinga, in Germania, per lavorare nel laboratorio di Ernst Felix Hoppe-Seyler, il pioniere della biochimica che battezzò l’emoglobina (il pigmento rosso del sangue). Dopo parecchi mesi di lavoro in un laboratorio allestito nella cantina del castello di Tubinga, Miescher isolò una sostanza acida sconosciuta dalle cellule bianche del sangue (leucociti); si procurava i leucociti lavando le bende piene di pus di un vicino ospedale. Miescher chiamò questa sostanza “nucleina” perché era localizzata nel nucleo delle cellule. Hoppe-Seyler, essendo la sostanza ancora impura, volle ripetere la procedura egli stesso prima di dare il suo consenso alla pubblicazione della scoperta sulla rivista di biochimica che aveva appena fondato.

Ritornato a Basilea nel 1870, Miescher perfezionò il metodo e fu in grado di estrarre materiale nucleare dallo sperma dei salmoni del Reno, fiume che allora era rinomato proprio per i salmoni. Così come quello dei leucociti, il nucleo degli spermatozoi è relativamente grande. Proprio dagli spermatozoi di salmone Miescher estrasse la nucleina pura per la prima volta. Nel 1889 un suo allievo, Richard Altmann, sostituì al termine nucleina quello moderno di acido nucleico. Quindi nel 2003 noi abbiamo festeggiato 50 anni della doppia elica e non ’50 anni di DNA’.

E’ affascinante per un docente di scienze leggere un resoconto dei  metodi di Miescher, anche per la notevole somiglianza tra le tecniche poco raffinate allora disponibili e molti degli odierni protocolli scolastici. Se paragonati a Miescher comunque gli insegnanti di oggi hanno vita più facile. Non avendo frigoriferi, Miescher era costretto ad iniziare a lavorare alle 5 del mattino per assicurarsi che i reagenti fossero sufficientemente freddi per poter precipitare il DNA, poi doveva prepararsi da solo le proteasi isolandole dallo stomaco di maiali appena macellati (Judson, 1996).

Protocolli per la scuola

Nel corso degli ultimi 20 anni l’isolamento del DNA a partire da materiali facilmente reperibili è diventata un’attività largamente diffusa nei laboratori scolastici. Sebbene molti esperimenti simili siano stati descritti precedentemente (per esempio Sands, 1970),  molti non possono essere proposti a scuola sia per la loro complessità che per l’uso di reagenti pericolosi (Falconer & Hayes, 1986). Metodi più semplici per isolare il DNA sono comparsi sui manuali americani della metà degli anni ’80 (Helms et al., 1986), diffondendosi successivamente nei progetti specialistici di biotecnologia della scuola (per esempio Rasmussen & Matheson, 1990). Dall’inizio del 1990 questi esperimenti hanno varcato l’Atlantico e sono comparsi in pubblicazioni inglesi e tedesche (Bayrhuber et al., 1990; NCBE, 1991). Con l’introduzione di procedure semplici e poco dispendiose, gli esperimenti che prima erano esclusivamente riservati agli studenti universitari ora potrebbero essere proposti anche agli alunni delle scuole primarie  (Assinder, 1998).

Il DNA dalle cipolle

Il metodo più comunemente usato (se non, per ovvie ragioni, il più popolare) per estrarre il DNA utilizza niente altro che cipolle, un detergente casalingo ed acqua salata. Questo metodo è stato diffuso nel Regno Unito grazie ai corsi sperimentali ed alle pubblicazioni del  National Centre for Biotechnology Education (NCBE, 1991; 1993). Metodi più sofisticati per estrarre il DNA dal crescione e dai piselli secchi sono stati messi a punto da Science and Plants for Schools e dall’Australian CSIRO education centre 'The Green Machine' (NCBE, 2001); questi protocolli sono però più adatti a studenti più grandi, per  il fatto di prevedere l’elettroforesi su gel del DNA.

Alla ricerca di alternative più profumate alle cipolle, alcuni hanno applicato il ‘metodo delle cipolle’ ad un certo numero di frutti fra cui kiwi, banane e fragole. Ma questi frutti danno solola sensazione di estrarre grandi quantità di DNA, il ‘DNA’ isolato è infatti quasi esclusivamente pectina. Lo si può facilmente dimostrare aggiungendo pectinasi alla preparazione (è anche piuttosto facile precipitare la pectina in alcool, un vecchio trucco dei produttori di marmellata).

Il DNA dai piselli

Il protocollo che descriviamo prevede l’uso di piselli congelati. E’ un metodo che offre molti vantaggi rispetto a quello tradizionale delle cipolle. In primo luogo non è necessario alcun frullatore per rompere i tessuti vegetali; una volta che i piselli sono scongelati, possono essere schiacciati con la parte posteriore di un cucchiaio o con l’aiuto di una bacchetta di vetro. Poi possiamo facilmente conservare nel freezer dei piselli che possono così essere conservati ed in seguito opportunamente prelevati nelle quantità necessarie. Infine un’ultima ma non meno importante considerazione:  i  piselli non hanno odore! Isolare il DNA (e l’RNA) richiede circa 35 minuti, compresi i 15 minuti di  incubazione.

Prima di cominciare

L’etanolo deve essere freddo; metterlo in una bottiglia di plastica nel freezer almeno 24 ore prima di iniziare. Leggere le note relative alla sicurezza riportate più avanti.

Materiali necessari per ciascuna persona o gruppo

• Piselli, circa 50 g (vanno benissimo quelli congelati, che devono essere precedentemente scongelati)
• Detergente liquido casalingo, 10 ml (usare il tipo diluito, non quello concentrato)
• Sale da tavola, 3 g
• Acqua distillata, 90 ml
• Etanolo freddissimo, circa 10 ml, direttamente dal freezer (anche l’alcool denaturato industriale va bene. Leggere le note relative alla sicurezza riportate più avanti)
• Novozymes Neutrase (una proteasi), 2-3 gocce
• Ghiaccio, in un contenitore con acqua fredda
• Carta da filtro per caffè (non usare la carta da filtro del laboratorio perché è necessario troppo tempo per filtrare la miscela)
• Una siringa di plastica da 1 ml (senza ago)
• Un grande imbuto di plastica
• Due beaker da 250 ml
• Provette resistenti al calore e provette graduate di plastica
• Bacchetta di vetro con un’estremità appiattita o un cucchiaio di plastica per mescolare la miscela
• Bagnomaria mantenuto a 60°C

Procedura

1. Sciogliere il sale in 90 ml di acqua  distillata. Aggiungere il detergente liquido e mescolare lentamente.
2. Schiacciare i piselli con un cucchiaio o con una bacchetta di vetro. Aggiungere la pasta  di piselli ad un beaker contenente la soluzione contenente il sale ed il detergente.
3. Porre il beaker a bagnomaria a 60°C per 15 minuti esatti. Questo trattamento consente di rompere le pareti e le membrane delle cellule dei piselli.
   Il detergente forma dei complessi con i fosfolipidi e le proteine di membrana, provocandone la precipitazione. Inoltre, gli ioni sodio del sale schermano le cariche negative dei gruppi fosfato presenti nel DNA, facendoli associare. A 60°C, le DNasi, gli enzimi che idrolizzano il DNA frammentandolo, sono parzialmente denaturate.
4. Raffreddare la miscela immergendo il beaker nell’acqua contenente ghiaccio per 5 minuti, agitando lentamente ed in continuazione.
   Questo passaggio evita che, mantenendo la temperatura a 60°C, il DNA si idrolizzi.
5. Filtrare la miscela in un secondo beaker. Assicurarsi che il filtrato non sia contaminato dalla schiuma presente nella parte superiore del liquido.
   Il filtrato contiene proteine solubili e DNA.
6. Opzionale: in una provetta aggiungere 2-3 gocce di proteasi a circa 10 mL dell’estratto di piselli e mescolare bene.
   La proteasi degraderà la maggior parte delle proteine presenti.
7. Con molta cura e lentamente aggiungere l’etanolo (o l'alcool denaturato) freddo su un lato della provetta per formare uno strato al di sopra dell’estratto di piselli.
8. Lasciare riposare la provetta per qualche minuto.
   Gli acidi nucleici (DNA ed RNA) sono insolubili in etanolo freddo e precipitano nello strato di etanolo sovrastante.

Ulteriori suggerimenti

Un gancio per recuperare il DNA può essere realizzato riscaldando velocemente la punta di una pipetta Pasteur sul becco Bunsen, piegando ed arrotondando la punta prima che il vetro si raffreddi. Per fare l’elettroforesi dell’estratto di DNA, solubilizzarlo in circa 0.5 ml di blu di bromofenolo, e caricarne 20 µl nel pozzetto in un gel di agaroso all’1%. La colorazione con la soluzione di Azure A al 0.04% (m/v) dopo l’elettroforesi rivelerà gli acidi nucleici. L’RNA dà una colorazione rosa più chiara (Madden, 2000).

Varianti a questa procedura di estrazione possono essere messe a punto partendo da altre fonti, come sperma di pesce o uova di pesce (Strömberg, 2001). Molte pubblicazioni prevedono il timo di vitello, ma il suo uso nelle scuole degli Regno Unito non è più consigliato (leggere le note relative alla sicurezza riportate più avanti).

Sicurezza

L’etanolo nel freezer

La maggior parte dei freezer non è a prova di scintilla. Quindi, dovete assicurarvi che l’etanolo sia posizionato nel freezer in un contenitore sigillato che non faccia uscire il vapore. In alternativa all'uso del freezer, il contenitore sigillato con l’etanolo deve essere messo in ghiaccio parecchie ore prima dell’uso. Per maggiori informazioni sulla sicurezza per le scuole che lavorano col DNA, i docenti degli Regno Unito possono consultare Topics in Safety (Delpech & Madden, 2001).

Uso di tessuti animali

Nel Regno Unito, dopo la scoperta del morbo della mucca pazza e della variante della malattia di Creutzfeldt-Jakob, le autorità responsabili della sicurezza  scolastica raccomandano di non usare più il timo del vitello a scuola, poichè c’è un rischio (anche se piccolo) di esposizione accidentale all'agente contagioso durante la preparazione dell'estratto.

Fornitori

La maggior parte degli materiali necessari a questa procedura si possono trovare al supermercato. Novozymes Neutrase può essere comprato in piccole quantità presso il National Centre for Biotechnology Education del Regno Unito.

Ringraziamenti

Questo articolo è stato precedentemente pubblicato su School Science Review nel Marzo 2003.