Vertaald door Raoul Tan
Dean Madden verbonden aan het National Centre for Biotechnology Education(Nationaal Centrum voor Biotechnologisch Onderwijs) van de Universiteit van Reading, VK, beschrijft hoe DNA werd ontdekt – en hoe makkelijk het geisoleerd kan worden in de klas.
 Johann Friedrich Miescher |
In 1868, reisde Johann Friedrich Miescher van zijn geboorteland Zwitserland naar Tübingen in Duitsland. De 24-jarige was naar het laboratorium van Ernst Felix Hoppe-Seyler gegaan, een pionier in de biochemie die verantwoordelijk is voor de huidige naam van het rode pigment in bloed: haemoglobine. Na enkele maanden werk in een laboratorium in de kelder van Kasteel Tübingen, kreeg Miescher het voor elkaar om een tot dan toe onbekende zure substantie te isoleren uit witte bloedcellen (leukocyten), die hij had verkregen door met pus doordrenkte verbanden uit een naburig ziekenhuis te wassen. Miescher noemde zijn ontdekking “nucleine” omdat hij het in de nuclei van cellen had gevonden. De substantie echter, was onzuiver, en Hoppe-Seyler stond erop om het werk zelf te herhalen voordat hij toestond om het te publiceren in zijn nieuw opgezette biochemische tijdschrift. |
Na zijn terugkeer in Basel in 1870, lukte het Miescher om de methode te verfijnen en was hij in staat om nuclei te isoleren uit het sperma van zalmen, waar de Rijn toendertijd beroemd om was. Net zoals in leukocyten zijn de celkernen van zalmsperma relatief groot. Uit deze kernen lukte het Miescher voor de eerste keer om zuivere nucleine te isoleren. In 1889 gaf een van zijn leerlingen, Richard Altmann, ons de huidige naam voor het nucleine: nucleinezuur. Dus eigenlijk vierden we in 2003 het gouden jubileum van de dubbele helix en niet de ‘vijftig jaar van het DNA’ [redactie – n.a.v. de ontdekking van de DNA structuur door Watson & Crick, die uitgebreid gevierd is in het VK].
|
Voor een biologie of scheikundeleraar is een verslag van Mieschers methodes fascinerend, niet in de laatste plaats omdat de toen beschikbare, groffe technieken die hij gebruikte een opvallende overeenkomst vertonen met de huidige protocollen in het klaslokaal. Vergeleken met Miescher echter, hebben docenten vandaag een makkelijke tijd. Aangezien Miescher geen koelkast had moest hij al om 5 uur ’s ochtends beginnen, om er zeker van te zijn dat zijn reagentia koud genoeg waren om het DNA te laten precipiteren. Ook moest hij zelf zijn protease enzymen isoleren uit de magen van versgeslachte varkens (Judson, 1996).
|
 Het laboratorium in Tübingen waar Miescher nucleine isoleerde. Foto beschikbaargesteld door de universiteitsbibliotheek van Tübingen, Tübingen, Duitsland |
DNA isolatietechnieken voor in de klas
De isolatie van DNA van alledaagse materialen is een populair en wijdverbreide activiteit geworden in scholen over de afgelopen 20 jaar. Hoewel soortgelijke methodes al eerder waren beschreven (b.v. Sands 1970) werden deze niet toegepast vanwege de complexiteit en het gebruik van gevaarlijke stoffen (Falconer & Hayes, 1986). Eenvoudiger methodes om DNA te isoleren verschenen voor het eerst in Amerikaanse schoolboeken midden in de 80-er jaren (b.v. Helms et al., 1986) en vervolgens verschenen er meer gespecialiseerde biotechnologieprojecten voor in de klas (b.v. Rasmussen & Matheson, 1990). In het begin van de 90-er jaren sloegen deze methodes over naar Europa en verschenen ze in Duitse en Engelse tijdschriften (Bayrhuber et al., 1990, NCBE, 1991). Met het verschijnen van eenvoudige en goedkope technieken werden deze bovenbouwtechnieken ook geschikt voor onderbouw en zelfs voor de lagere school (Assinder, 1998).
DNA uit uien
De meest toegepaste (en zo niet, dan toch de meest populaire) methode om DNA te isoleren vereist niet meer dan uien, afwasmiddel en een zoutopplossing. De methode werd populair in het VK door de gegeven workschops en publicaties van het National Centre for Biotechnology Education (NCBE, 1991; 1993). Wat verfijndere DNA isolatie methodes uit waterkers en gedroogde erwten werden ontwikkeld door “Science and Plants for Schools” en het Australisch CSIRO onderwijscentrum “the Green Machine” (NCBE, 2001), maar het toegevoegde gelelectroforeseonderdeel maakt de methodes alleen geschikt voor oudere leerlingen uit de bovenbouw.
In de zoektocht naar zoeter ruikende alternatieven voor uien hebben sommigen geprobeerd om de “uienmethode” toe te passen op verschillende vruchten zoals kiwi’s, bananen en aardbeien. Hoewel deze vruchten enorme hoeveelheden DNA lijken op te leveren is het “DNA” niet meer dan pectine. Dit kan heel makkelijk aangetoond worden door pectinase toe te voegen tijdens de bereiding (het is ook makkelijk om pectine te laten neerslaan in alcohol – een oude truuk bij jammakers).
DNA uit erwten
Het hier beschreven protocol gebruikt bevroren erwten. Dit heeft enkele voordelen t.o.v. de traditionele uienmethode. Ten eerste is er geen blender nodig om het plantemateriaal kapot te maken. Als de erwten ontdooid zijn dan kunnen ze geprakt worden met de achterkant van een lepel of glasstaaf. Ten tweede kunnen erwten gemakkelijk opgeslagen worden in de vriezer en afgepaste hoeveelheden kunnen makkelijk ontdooid worden wanneer ze nodig zijn. Tot slot, niet onbelangrijk, erwten ruiken niet! Het isoleren van DNA (en RNA) duurt ongeveer 35 minuten, inclusief een incubatietijd van 15 minuten.
Voorbereidingen
De alcohol (ethanol) moet ijskoud zin. Giet de ethanol in een plastic fles voor tenminste 24 uur voordat je met het experiment begint. Lees het stukje over veiligheid voor je er mee begint.
Materiaal nodig per persoon/groep
- Erwten, ongeveer 50 g (bevroren erwten zijn bruikbaar, maar ontdooi ze eerst)
- Afwasmiddel, 10ml (normale, waterige oplossing, geen concentraat).
Tafelzout, 3 g - Gedestilleerd water, 90ml
- IJskoude ethanol, 10ml, rechtstreeks uit de vriezer (industriële alcohol is bruikbaar, maar houd je aan de veiligheidsvoorschriften – zie ook onderaan dit artikel)
- Novozymes Neutrase (een protease), 2-3 druppels
- IJs, in een kom koud water
- Koffiefilterpapier (gebruik geen laboratorium filter papier, omdat het dan te lang duurt voordat de vloeistof erdoor gelopen is)
- 1 plastic spuit (zonder naald)
- Grote plastic trechter
- Twee 250ml maatbekers
- Plastic buis of reageerbuis, bestand tegen koken
- Glazen staafje met afgeplat eind of een lepel om te roeren
- Waterbad op 60°C
Methode
- Los het zout op in 90 ml gedestilleerd water, voeg het afwasmiddel toe en meng voorzichtig.
- Plet de erwten met de glasstaaf of een lepel. Breng de erwtenpulp over in het bekerglas met de zoute afwasmiddeloplossing.
- Plaats het bekerglas in het 60°C waterbad voor exact 15 minuten. Deze behandeling breekt het celmembraan van de erwtecellen af.
De zeepdeeltjes vormen complexen rondom de membraanfosfolipiden en eiwitten waardoor deze neerslaan. Bovendien schermen de natriumionen van het zout de negatief geladen fosfaatgroepen van het DNA af, waardoor het een beetje visceus wordt. Bij 60°C worden de DNAses, enzymen die het DNA afbreken, gedeeltelijk gedenatureerd. - Stop de maatbeker in een ijswaterbad voor 5 minuten om de vloeistof af te laten koelen. Blijf wel regelmatig roeren.
Het afkoelen vertraagd het afbraakproces van het DNA, dat wel plaats zou hebben gevonden als de hoge temperatuur gehandhaafd zou blijven. - Filtreer de oplossing en giet het filtraat in een tweede bekerglas. Zorg ervoor dat geen enkel schuim in het filtraat terecht komt.
Het filtraat bevat het DNA en oplosbare eiwitten. - Optie: voeg 2-3 druppels protease toe aan ongeveer 10 ml van het erwteextract in de reageerbuis en meng.
De protease zal enkele eiwitten in het preparaat afbreken. - Giet zeer voorzichtig ijskoude ethanol via de wand van de reageerbuis, zodat het een laagje vormt bovenop het erwteextract.
- Laat het buisje voor enkele minuten staan.
Nucleinezuren (DNA en RNA zijn onoplosbaar in koude ethanol en zullen neerslaan in de bovenste laag (ethanol).
Verder onderzoek
Een haakje om het DNA op te vissen uit de reageerbuis kan worden gemaakt door de punt van een pasteurpipet te verhitten in de vlam van een Bunsenbrander, buig de punt voor het glas weer afkoelt. Los een beetje van het DNA op in 0,5ml broomfenolblauwe opbrengbuffer om DNA te scheiden. Laad 20 ml van de oplossing in een laantje van de 1% agarose gel. Toevoeging van 0,04% (w/v) Azure A oplossing na de electroforese kleurt het DNA. RNA kleurt lichter rose dan het DNA (Madden, 2000).
Variaties op de DNA extractie/isolatieprocedure kan worden gebruikt voor andere levensmiddelen zoals vissesperma of kuit (Strömberg, 2001). Sommige publicaties verwijzen naar het gebruik van kalfsthymus, maar dat gebruik wordt op scholen niet meer aanbevolen (zie veiligheidsmaatregels, hieronder).
Veiligheidsmaatregels
Alcohol in de vriezer
De meeste vriezers zijn niet vuur-vrij. Daarom moet je er zeker van zijn dat de alcohol wordt bewaard in een afgesloten, luchtdichte container. Als alternatief voor de vriezer kan de afgesloten fles enkele uren op ijs staan voor gebruik. Voor meer informatie over veiligheid op school tijdens het werken met DNA raadpleeg Topics in Safety (Delpech & Madden, 2001, in het engels).
Gebruik van dierlijk materiaal
Sinds de constatering van bovine spongiform encephalopathy (BSE) en variant Creuzfeldt-Jakob disease in het VK, adviseert Britse schoolveiligheidscommissie om niet langer kalfsthymus te gebruiken, omdat er een (kleine) kans is op blootstelling aan besmettelijk materiaal tijdens het bereiden van het extract.
Leveranciers
De meeste materialen kunnen gekocht worden in de supermarkt. Novozyme Neutrase kan worden verkregen in kleine volumes van de Britse National Centre for Biotechnology Education.
Referenties
Assinder S (1998) Discovering DNA: 'The Recipe of Life'. Swindon, UK: Biotechnology and Biological Sciences Research Council
Bayrhuber H, Gliesche Ch, Lucius ER (1990) DNA-Isolierung mit einfachen Mitteln (Isolation of DNA using simple methods). Unterricht Biologie 14: 44
Delpech R, Madden D (2001) Working with DNA. In Topics in Safety (Third Edition) pp 99-105. Hatfield, UK: Association for Science Education
Falconer AC, Hayes LJ (1986) The extraction and partial purification of bacterial DNA as a practical exercise for GCE Advanced level students. Journal of Biological Education 20: 25-26
Helms D et al. (1986) Biology in the Laboratory. New York, NY, USA: WH Freeman & Co
Judson HF (1996) The Eighth Day of Creation: Makers of the Revolution in Biology. New York, NY. USA: Cold Spring Harbor Laboratory Press
Madden D (2000) Illuminating DNA. Reading, UK: National Centre for Biotechnology Education
NCBE (1991) DNA your onions? NCBE Newsletter Spring 1991
NCBE (1993) Practical Biotechnology. A Guide for Schools and Colleges. Reading, UK: National Centre for Biotechnology Education
NCBE (2001) Investigating Plant DNA. Reading, UK: National Centre for Biotechnology Education
Rasmussen AM, Matheson RH (1990) A Sourcebook of Biotechnology Activities. Reston, VA, USA: National Association of Biology Teachers
Sands MK (ed; 1970) Nuffield Advanced Science Laboratory Guide. London, UK: Longman
Strömberg E (2001) DNA from 'caviar'. Bioscience Explained 1(1)
Ter kennisgeving
Dit artikel is eerder verschenen in School Science Review in maart 2003.
 |
 |
 |
 |
