Romalılara ait yollar, tren istasyonlaı ve kontrolörler: RNA araştırmalarında son buluşlar

Tercüme eden: Hikmet Geckil (İnönü Üniversitesi, Biyoloji Bölümü)

Detlev Arendt, Peer Bork ve Florian Raible en hızlı ve en yavaş evrimleşenleri bulmaya çalışıyorlar Resim EMBL Photolab’ın izniyle

RNA çok önemli bir biyolojik molekül olup ders kitaplarında bu molekülden nadiren detaylı baysedilir. Bu yazı dizisinin ilk makalesinde, Russ Hodge RNA konusunda en son yapılan bazı ilginç araştırmaları sunmaktadır. Eski zamanlarda bir Romalının bir tepenin üzerinde durup yeni bir yol için manzaraya baktığını düşünelim. İki bin yıl sonra o Romalının yaptığı yollar günümüzde hala birçok Avrupa şehir ve kırsalında adeta bir cetvelle çizilmiş gibi durmakta olup, sadece en şiddetli doğal afetlerle yer yer bir nebze değişikliğe uğramıştır. 1950 ve 1960’larda bilim adamları hücre içinde farklı moleküller arasında bağlantıları tanımlayan benzer yolların biyolojik haritalarını yaptılar.

Onların planı moleküler biyolojinin sentral dogması olarak bilinir: “DNA RNA’yı, RNA proteinleri yapar” yazmıştı James Watson not defterine, o ve Francis Crick DNA’nın yapısı üzerine çalışmalarına başladıkları zaman. Bu iki adam dogma teorileri ile hücrenin esas molekülleri arasında yeni bir ilişki ileri sürdüler- bilginin nükleik asitlerden proteinlere tek yönlü akışı. DNA çift sarmalını keşiflerinden hemen sonra; Crick bir konferansla dogmayı moleküler biyolojinin büyük bir araştırma planı olarak sundu (Crick, 1970): bilim adamları bu transformasyonların nasıl olduğunu açıklayacak mekanizmalar için zaman ayırmalı idiler.

1970’lerin sonuna doğru RNA ve proteinlerin nasıl oluştuğuna dair temel şeyler bilinmeye başlanmış olsa da, doğrusal tek bir yolun hücrenin kimyasını açıklamaya yetmeyeceği açık şekilde görüldü. Aynen eski Romalılardan kalma yollara eklenen ve onların dallanmasına sebep olan günümüz modern yolları gibi, genler ve proteinler arasında da yeni sapmalar keşfedildi. Başlangıçta bunların dogmadan basit sapmalar olduğu sanıldı; fakat aynı zamanda bu istisnaların kompleks organizmalarda birçok biyolojik olay için yaygın ve önemli oldukları anlaşıldı. Bulguların bazıları henüz ders kitaplarına girmeyecek kadar yeni olup, öğretmenler tarafından bilinmemektedir. Bu yazı Science in School için hazırlanmış bir serinin ilk makalesi olup bu en son araştırmaları kapsamaktadır.

En ilginç bulguların bazıları bir zamanlar protein yapımında son bir araç gözü ile bakılan RNA konusunda olmuştur. Son 10 yılda bu moleküllerin hücrenin kendi genomundaki bilgiyi kontrolde hayati rollerinin olduğu saptanmıştır. RNA’ların nasıl kullanıldıklarının anlaşılması, hastalıkların daha iyi kavranması ve RNA’ların bozuk genlerin etkisine karşı kullanılmasını mümkün kılacak tedavi amaçlı kullanımları dahil birçok yeni biyoteknoljik uygulamalrı gündeme getirdi.

Alternatif kesilim (işlenim)

Sentral dogmanın RNA’sı mesajcı RNA olup, proteinlerin yapımında kalıp olarak kullanılır. Ökaryotlarda mesajcı formunu kazanmadan önce RNA’ların işlenmesi gerekir. Taze yapılmış RNA’lar, taşıdıkları malların müşterilerin arzusuna göre sınıflanması gereken birçok vagondan oluşan uzun bir trene benzetilebilirler.  Boş vagonlar ayrılır, öndeki veya arkadaki dolu vagonlar birleştirilir. Boş vagonların hücresel karşılıkları genlerde bulunan uzun, protein kodlamayan bölgeler olan intronlardır. Protein kodlayan DNA dizileri ekzonlar olarak adlandırılırlar. Sıklıkla bir ekzon bir proteindeki bir modül (bölge) için bilgi taşır. Bunlar bile çoğu zaman kullanılmazlar. Bir müşteri istemediği mallarla dolu vagonların da boş vagonlarla beraber trenden ayrılmasını isteyebilir. Ve bir hücre bir belli bir proteindeki tüm modüllere gereksinim duymayabilir. Bu nedenle çeşitli ekzonlar biri birine bağlanarak farklı formlar ortaya çıkarabilirler.

Alternatif işlenim denen bu olay 1977 yılında New England Biolabs (ABD)’dan  Richard Roberts ve Massachusetts Institute of Technology (ABD)’den Phillip Sharp tarafından ayrı ayrı keşfedildi (Berget et al., 2000). Bu buluş o kadar önemli idi ki, sahiplerine 1993 Nobel Fizyoloji ve Tıp Ödülünü kazandırdiw1. Bu sıralarda işlenimin pek de sık görülen bir şey olmadığı sanılıyordu; Sharp insan genlerinin yaklaşık % 5’inin bu tür bir işlenime gidebileceğini hesaplamıştı. İnsan genom dizisinin bütünü ele alındığında, ortalama bir insan geninde hepsinin bu işlenimle kesilip atılmaları gereken 8.4 intron olduğunu ortaya koymuştur. Her ne kadar bazı insan RNA’ları daima aynı yolla işlense de, bilim adamaları genlerimizin en az % 75’ininin alternatif işlenime gittiklerini tahmin etmektedirler.

Sıklıkla aynı RNA alternatif formlara işlenerek farklı protinlerin sentezinde kullanılacak mesajcı RNA’lar yapabilir. İşleme intron adı verilen kodlamaya girmeyen dizilerin kesilip atılmasını içerir. Ancak bazan kodlamaya giren bazı ekzonlar da intronlar gibi kesilip atılır. Bir ekzonun kaybı veya bir ekzonun ilavesi hücrede dramatik etkileri olan farklı formda proteinlerin ortaya çıkmasına sebep olur. Resim EMBL Photolab’ın izniyle

İnsan genleri diğer birçok organizmanınkinden çok daha fazla sayıda introna sahiptir; sinek ve diğer böcekler için gen başına intron sayısı ortalama 2.4 ila 5.4 arasında değişmektedir. (buna rağmen, en son dünya rekoru meyve sineğinde bulunan ve dscam adı verilen bir gene ait olup bu gen 38,016 adet farklı protein yapabilmektedir.) Bazı bilim adamları insan genlerindeki yüksek sayıda intronun zamanla komplesliğe doğru gidildiği anlamını çıkarmışlardır. Ancak, Almanya Heidelberg’deki Avrupa Moleküler Biyoloji Laboratuarı (EMBL)’ndan Detlev Arendt ve Peer Bork ve gruplarının çalışması böcek ve omurgalıların eski atalarının genlerinin insanlardaki gibi çok sayıda intronla sahip olduklarını göstermiştir (Raible et al., 2005). Genler sinek ve diğer hızlı çoğalan türlerde evrim süreci boyunca daha dinamik bir yapı aldılar.

Bir gendeki intronların toplam uzunluğunun ekzonlarla kıyaslanmasından da türler arasında ilginç farklar görülmektedir. Bir kurtçuk olan Caenorhabditis elegans ve birçok diğer türde intronlar ve ekzonlar aynı sayıda “harf” (nukleotid) içerirler. Bu durum insanda oldukça farklıdır: bir gendeki intronlar toplam onbinlerce nukleotid içerebilir ve ortalama olarak ekzonlardan 5 kat daha uzundurlar. Bu, Harvard Üniversitesi (ABD)’den Cristian Castillo-Davis ve Biyoteknolji Bilgisi için Ulusal Merkez (ABD)’den Eugene Koonin ve Fyodor Kondrashov’ın çalışmalarından anlaşıldığı kadarı ile insan genlerinin evrimi üzerinde büyük etkiye sahip olmuştur (Castillo-Davis et al., 2002). RNA transkripsiyonu yavaş ve enerjice pahalıya mal olan bir olaydır: birçok intronu olan tek bir genden RNA’ların yapımı birkaç dakikaya ve binlerce ATP molekülüne gereksinim duyabilir. Araştırıcılar, sık kullanılan genlerin intronlarının seyrek kullanılanlara göre ortalama 14 kat daha kısa olduklarını belirlemişlerdir. Vardıkları sonuç: en yaygın kullanılan genlerde zaman ve enerji tasarrufu için doğal seçilimle intronlar kısalmaya devam etmektedir.

Bir kere alternative işlenim için hücresel mekanizma gelişince, o birçok farklı şekillerde kullanıma sokulabilirdi. Modüllerin eşleşmesi ve karışımları farklı özellikte proteinler üretirler. Özellikle farklı dokuların gelişmesinde bunlar farklı tipte hücre ve şekillerin ortaya çıkmasında önemli roller oynarlar.  Tavukların kulağında Slo adı verlen alternatif işlenimle farklı frekanslarda sesleri işitme duyusu gelişir. Sineklerde üç adet kritik protein erkek ve dişide farklı işlenerek cinsiyetler arasında önemli farkaların oluşması sağlanır. Dişiler iki adet X, erkekler bir adet X kromozomuna sahip oldukları halde, bu proteinler sayesinde dişi kromozomlarındaki geneler erkekelerin tek X kromozomu üzerinedki genlerden iki kat fazla protein üretmezler. Brown Üniversitesi (Rhode Island, ABD)’den Diane Lipscombe ve arkadaşları alternatif işlenimin özellikle fare ve diğer memelilerin beyinlerinde yaygın olduğunu keşfetmişlerdir (Lipscombe, 2005). Moleküllerin bazıları hafıza ve öğrenmede kritik önemlere sahiptir.

Geniş bir hastalık yelpazesinde işlenim önemli bir faktördür. Neurofibromatosis adı verilen ve sinir ve diğer dokularla beraber gelişen şiddetli bir genetik hastalıkta hastaların yarısında neurofibromin geninindeki mutasyonlardan dolayı alternatif işelnimle yapılan RNA’ların üretiminde değişiklik görülür. Anemi ile kendini gösteren beta-talasemi hastalığında, hastalık hastaların kırmızı kan hücrelerinde fonksiyonel olmayan beta-globin proteinlerinin üretimi ile olur; bu şiddetli hastalık ilgili genin yanlış işlenmesi ile ortaya çıkar. BRCA1 (göğüs kanseri ile bağlantılı gen) ve CFTR (kistik fibrosis ile bağlantılı gen) genlerindeki değişişimler diğer örnekler olarak verilebilirler. Ekzonlarda hastalıkla ilgili mutasyonların yaklaşık % 50’si RNA’nın nasıl işlendiği ile ilgilidir. Tümör ve nörodejenaratif hastalıklarda normalde sağlıklı dokularda bulunmayan olağandışı işlenmiş RNA’lar bulunur.

Kalite kontrolü

1979 yılında CNRS (Strasbourg, Fransa)’dan Regine Losson ve François Lacroute hücrelerin RNA’ları denetleyen ve kalite kontrolü yapan bir sisteme sahip olduklarını keşfettiler (Losson & Lacroute, 1979). Yaklaşık otuz yıldır yapılan çalışmalar bu sistemin mükemmel çalışmadığını, fakat ökaryotik hücreleri birçok mutasyonun zararlı etkisinden koruduğunu ortaya koydu. Genlerde meydana gelen ve bir proteinin şekil, yapı ve fonksiyon bozukluğu ile kendini gösteren değişiklikler hücrede kötü etkiler ortaya çıkarırlar. İşlenmede meydana gelen hatalar da böyle sonuçlar doğurabilirler ve anlamsız-aracılı mRNA bozulması (İng. nonsense-mediated mRNA decay (NMD)) adı verilen denetleme sisteminin her zaman alarmda olması gerekir.

Her ne kadar bilim adamları NMD’yi nukleusta olan RNA işlenmes ile ilgili olarak belirlemişlerse de, bu denetleme olayı bir RNA sitoplazmaya girmeye başladığında gerçekleşir (Sun et al., 2000). Takip eden vagonlardan hangilerinin boş olduğunu göstermek için bir vagona yapıştırılmış işaretler gibi hücre bir küme proteini intronların kesilip atıldığı bölgelere bağlar. Bu protein kümesi en az altı proteinden meydana gelmiş olup ekzon bağlantı komleksi (İng. exon junction complex (EJC)) olarak bilinir. Bu kompleks, işlenim bölgelerinde konumlanmış olup bulunduğu pozisyon RNA’nın son hali üzerinde önemli bir etkiye sahiptir.

Resim Ed Green’in izniyle

Bir RNA’nın proteine translasyonu ribozom adı verilen ve bir mesajcı RNA’yı bağlayıp onun üzerindeki kodu okuyarak ondan diziye uygun bir amino asit zinciri oluşturan moleküler bir makine ile olur. Molekül üzerinde bulunan herhangi bir EJC molekülü basitçe uzaklaştırılır. RNA’nın protein kodlayan kısmının sonunda ribozom, stop kodonu adı verilen üç-harflik sinyalle karşılaşır ve bitmiş olan protein salınır. Mutasyonlar sıklıkla bir RNA’nın okunmasını değiştirirler ve böylece bir stop kodonu molekülün ortasında bir yerde ortaya çıkabilir. Bu RNA üzerinde hücrede herhangi bir anlam ifade etmeyen bir kodla sonuçlanır (NMD’deki “nonsense”, yani “anlamsız”) ve bir EJC’yi RNA üzerinde bırakarak NMD’yi göreve çağırır (bkz. şekil).

Potansiyel olarak zarara sebep olabilecek proteinlerin yapımını önlemek için, bir stop kodonundan yaklaşık 50 nukleotid sonra bulunan EJC’ler NMD’ler tarafından tanınır. Translasyon olayı kesintiye uğrar ve diğer moleküller gelip RNA’yı uzağa taşıyarak onu parçalanmaya sunar.

Fakat bazı RNA’lar NMD denetiminden kaçabilir ve zararlı proteinler üreterek hastalıklara sebep olabilirler. Hatta NMD denetimi çalışsa bile sonuç yine de hastalık olabilir. Çünkü bu denetim hücre için gerekli ancak hasar görmüş bir RNA’yı ortadan kaldırabilir. 1989 yılında Roswell Park Memorial Enstitüsü’nden (New York, ABD) Lynne Maquat’ın laboratuarı NMD’nin batı dünyasında en yaygın görülen genetik hastalıklardan biri olan beta-talasemi’ye katkıda bulunduğunu ortaya koydu. Beta-talasemi kanda oksijeni taşımadan sorumlu hemoglobinin üretimini azaltır. Hastalık insanlarda beta-globin denen gende bir mutasyon sonucu ortaya çıkar; NMD mutasyonu yakalar ve beta-globin RNA’sını parçalanmaya sunar. Bu önemli bir molekülün ortadan kalkması anlamına gelir (Lim et al., 1989). Bu, normalde bir güvenlik mekanizması olan NMD’nin vücudun kendisine saldırması anlamına gelir.

Son yıllara kadar NMD, hatalı RNA'ları yakalayan bir araç olarak görüldü; şimdi onun bazı moleküllerin nicelik ve niteliğinin kontrolunde daha genel bir araç olduğu anlaşılmaktadır. Bunun nedeni normal alternatif işlenim mekanizması ile bazan anlamsız kodonlara sahip RNA'ların üretilmesidir; bazı nedenlerden, kes-ve-yapıştır sistemi bir RNA'nın ortasında anlamsız bir kod üretebilir. 2004 yılında University of California (Berkeley, ABD)’den R. Tyler Hillman, Richard Green ve Steven Brenner bilgisayar analizi ile alternatif işlenimin yaklaşık yüzde otuz oranla bir kesim bölgesinin 50 nukleotid önüne bir stop kodonu oluşumuna sebep olduğunu hesaplamışlardır. Bu NMD’yi aktive eder ve o da RNA’nın çoğunu proteinlere dönüşmeden ortadan kaldırır (Hillman et al., 2004).

Aynı yıl John Hopkins Üniversitesi Tıp Okulu’undan (Maryland, ABD) Harry Dietz’in grubu bu etkiyi memeli hücrelerinde çalıştı. Araştırıcılar denetim sistemi için gerekli Upf1 adı verilen bir proteini uzaklaştırarak NMD sisteminin çalışmasını durdurdular. Bu, büyük sayıda genin davranış şeklini etkiledi: onların çalıştıkları genlerin % 10’u daha üreteken olmuştu. Bunun muhtemel nedeni normalde NMD ile yakalanıp parçalanacak işlenmiş formların, sistemin yokluğunda kontrolden kaçıp proteine ifade edilmeleri olarak düşünülmüştür (Mendell et al., 2004).

Bu, alternatif işlenim gibi, NMD’nın genler ve proteinler arasında yaygın kullanılan bir ara-yol olduğunu göstermektedir. Bunlardan daha birçok olup Science in School’un gelecek sayılarında tartışılacaklardır. Eğer merakınız çok büyükse, işte sizi meşgul edecek bir bilmece: mor petunyaların rengi tek kopya olarak bulunan özel bir genden kaynaklanır. Bu genden ikinci bir tane petunya çiçeklerine aktarırsanız sonuç ne olur?

Referanslar

Berget SM, Moore C, Sharp PA (2000). Spliced segments at the 5’ terminus of adenovirus 2 late mRNA. Reviews in Medical Virology 10: 355-371

Castillo-Davis CI, Mekhedov SL, Hartl DL, Koonin EV, Kondrashov FA (2002) Selection for short introns in highly expressed genes. Nature Genetics 31: 415-418. doi:10.1038/ng940

Crick F (1970) Central Dogma of Molecular Biology. Nature 227: 561-563

Hillman RT, Green RE, Brenner SE (2004) An unappreciated role for RNA surveillance. Genome Biology 5: R8. doi:10.1186/gb-2004-5-2-r8

Lim S, Mullins JJ, Chen CM, Gross KW, Maquat LE (1989) Novel metabolism of several beta zero-thalassemic beta-globin mRNAs in the erythroid tissues of transgenic mice. The EMBO Journal 8(9): 2613-2619

Lipscombe D (2005) Neuronal proteins custom designed by alternative splicing. Current Opinion in Neurobiology 15: 358-363. doi:10.1016/j.conb.2005.04.002

Losson R, Lacroute F (1979) Interference of nonsense mutations with eukaryotic messenger RNA stability. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 76: 5134-5137

Mendell JT, Sharifi NA, Meyers JL, Martinez-Murillo F, Dietz HC (2004) Nonsense surveillance regulates expression of diverse classes of mammalian transcripts and mutes genomic noise. Nature Genetics 36: 1073-1078. doi:10.1038/ng1429

Raible F et al. (2005) Vertebrate-type intron-rich genes in the marine annelid Platynereis dumerilii. Science 310: 1325-1326. doi:10.1126/science.1119089

Sun X, Moriarty PM, Maquat LE (2000) Nonsense-mediated decay of glutathione peroxidase 1 mRNA in the cytoplasm depends on intron position. EMBO Journal 19: 4734-4744. doi:10.1093/emboj/19.17.4734

Web referansları

w1 –Philip Sharp’ın alternatif işlenimle ilgili Nobel konuşması metni, “Parçalı Genler ve RNA işlenmesi”ne aşagıdaki web adersinden ulaşılabilir: http://nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1993/sharp-lecture.pdf

Richard Roberts ve Philip Sharp’ın Nobel Ödülünü kazandıkları ve onların çalışmaları ile ilgili kısa basın bildirisi: http://nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1993/press.html

Ödül kazananların biyografileri dahil Nobel Ödülü hakkında daha fazla bilgi için: http://nobelprize.org/

Kaynaklar

Crick tarafından yazılmış birçok makaleye Nature websitesinde ücretsiz ulaşılabilir: www.nature.com/nature/focus/crick/

Yakında

Science in School’un gelecek sayısında: Görünmez mühendisler: mikroRNA’lar, küçük müdaheleci RNA’lar ve diğer kodlama-yapmayan RNA’lar

Russ Hodge bir bilim yazarı olup Helmholtz Association of German Research Centres’in bir üyesi olan Berlin’deki Max Delbrück Center for Molecular Medicine’dadır. O Heidelberg’deki EMBL’de Enformasyon ve Halkla İlişkiler Ofisinin eski başkanı olup, Science in School’a düzenli katkıda bulunmaktadır.