Prijevod: Sandra Vujnović Penco

Mrtvo more Fotografija uz dopuštenje EdwardShtern / iStockphoto

Giuseppe Zaccai iz Instituta Laue-Langevin (ILL) u Grenoblu, Francuska, opisao je kako su on i njegovi suradnici otkrili način kojim se može istražiti dinamika vode u unutrašnjosti stanice koristeći neutronsko raspršivanje i izotopsko markiranje. U usporedbi s drugim tekućinama voda ima neobična svojstva. Kako je voda bitna za sva živa bića, njezina svojstva imaju životno važnu ulogu na razini molekularne biologije - discipline koja nastoji razumjeti životne procese na razini atoma, molekula i njihovih međusobnih interakcija.

Hidrofobni učinak je jedno takvo svojstvo. Ono opisuje opažanje da se u otopini voda i ulje ne miješaju. Razlog tomu je što molekule vode stvaraju vodikove veze međusobno i s drugim molekulama (koje su nazvane hidrofilne), ali ih ne stvaraju s ulju sličnim molekulama (koje su nazvane hidrofobne) (više o ovoj temi pogledajte kod Cicognani, 2006). To je od temeljne važnosti u molekularnoj biologiji. Hidrofobni učinak dovodi do spontane organizacije lipidnih molekula da stvaraju membrane koje okružuju stanicu. Također doprinosi stvaranju trodimenzionalne strukture proteina, RNA i DNA, potpomažući njihovo savijanje tako da hidrofobne dijelove njihove strukture sakrije od molekula vode, a molekulama vode izloži hidrofilni dio.

Kao što je očito, hidrofobni učinak uvelike ovisi o posebnim dinamičko molekularnim svojstvima tekuće vode. Sudjelovanje ovog učinka u stvaranju membrane i savijanju makromolekula je utvrđeno iz pokusa s otopinama u kojima je voda u epruveti očito bila u tekućem obliku. Međutim, postojale su sugestije da voda u stanicama nije u svom prirodnom tekućem obliku nego je na neki način „ukroćena“ te da se ne može slobodno kretati unutar viskoznog unutarstaničnog okoliša, guste juhe od proteina i drugih molekula.

Marion Jasnin i Giuseppe Zaccai na ILLu Fotografija uz dopuštenje Giuseppea Zaccaia

Stoga je bilo važno da se izmjeri dinamika vode neposredno u živim stanicama. To nije bio lagan zadatak, ali posebna svojstva neutrona pomogla su znanstvenicima moje istraživačke grupe na ILLu^w1, kao i znanstvenicima s Instituta za strukturnu biologiju (Institut de Biologie Structural CEA-CNRS-UJF^w2) u Grenoblu, Francuska, da ga uspješno svladamo.

Tikvica s „deuteriziranim“ stanicama Haloarcula marismortui. Uočite crvenu boju halofilnih organizama, koja u prirodi daje boju slanim jezerima i slanim ribnjacima. Razlog tomu su karotenoidi u membranama stanice, koji ulaze u hranidbeni lanac i odgovorni su, primjerice, za boju ružičastih plamenaca. Fotografija uz dopuštenje Giuseppea Zaccaia

Prvo istraživanje dinamike vode u živim stanicama je izvedeno u ILLu na stanicama organizma koji žive u ekstremno slanim uvjetima Mrtvog mora (Tehei et al., 2007). Sol se koristi kao konzervans jer njene visoke koncentracije ubijaju mikroorganizme. Halofilni (koji vole sol) organizmi iz Mrtvog mora razvili su mehanizam uspješnog svladavanja visoke koncentracije soli tako da imaju makromolekule s izrazito povećanim hidrofilnim površinama. Te površine utječu na dinamiku vode unutar stanice, što je zaključeno na osnovi većeg broja dijelova sa “sporijom vodom” u stanicama organizma Mrtvog mora. Očito, ako ovo vrijedi za sve organizme, dovest će do kompletne revalorizacije ne samo hidrofobnog učinka nego i uloge vode općenito u biologiji. Stoga je bilo izrazito važno ispitati da li je to ponašanje karakteristično samo za halofilne ili vrijedi za sve organizme (Jasnin et al., 2008).

Na ILLu znanstvenici koriste neutronsko zračenje za ispitivanje različitih svojstva čvrstih i tekućih tvari. U pokusima s neutronskom stehiometrijom za mjerenje dinamike (kako se atomi kreću u tvari), neutroni u zraci se sudaraju s atomima koji se proučavaju, baš kao što se kugle u biljaru odbijaju jedna od druge. Neutroni i atomi razmjenjuju energiju i brzinu kretanja – neutroni se raspršuju. Dakle, mjereći kako se nakon sudara te vrijednosti neutrona mijenjaju daju nam naznake o energiji i brzini kretanja atoma koje susretnu, a time i kako se ti atomi kreću.

No kako možemo uočiti razliku između kretanja različitih atoma u složenom uzorku kao što je stanica, koja ne sadržava samo vodu nego i mnoge druge molekule čiji se atomi kreću u različitim smjerovima? Različiti atomi raspršuju neutrone različitom snagom. Da bi proučili složeni sustav znanstvenici su se poslužili trikom kojim su smanjili snagu raspršivanja svega onog što ne žele vidjeti. Vodik raspršuje atome mnogo jače nego svi drugi atomi (oko 10 do 100 puta, ovisno s kojim se atomom uspoređuje). Za razliku, deuterij, teški izotop vodika (njegova se jezgra sastoji od jednog neutrona i jednog protona) raspršuje neutrone 40 puta slabije nego vodik. Iskorištavajući to svojstvo, znanstvenici su zamijenili vodik s deuterijem u onim dijelovima složenog sustava za koje nisu zainteresirani i tako ih učinili praktički „nevidljivima“. Doprinos signalu raspršivanja od strane molekula koje sadrže deuterij je zanemariv; mi „vidimo“ samo kretanje molekula koje sadrže vodik.

Marion Jasnin i njezini suradnici upotrijebili su ovaj trik za analizu dinamike vode in vivo u citoplazmi bakterije Escherichia coli, koristeći izvore neutrona na ILLu i ISISuw3, UK. Proučavanje fizike na biološkom materijalu je uvijek težak zadatak, a rad na ljudskim stanicama je vrlo osjetljiv i složen. E. coli je bila dobra alternativa jer je lagana za rukovanje, a opet živi u ljudskim crijevima u sličnim fiziološkim uvjetima temperature i slanosti baš kao i naše stanice; i ne zaboravimo, smatralo se da je prilagodba citoplazme većoj slanosti bila uzrok “usporenju vode” kod halofila. Da se vodikovi atomi zamijene deuterijem u proteinima i drugim staničnim makromolekulama, stanice E. coli su se uzgajale na hranjivoj podlozi s deuterijem i na deuterijskoj (teškoj) vodi. U svrhu mjerenja, lagano su centrifugirane te je teška voda zamijenjena s normalnom vodom (koja sadržava vodik) razrjeđujući deuterij u unutarstaničnoj vodi, ali ne i na makromolekulama. U takvom uzorku, nakon razrjeđivanja, signal raspršivanja neutrona dolazio je uglavnom od unutarstanične vode. Kuglica živih stanica stavljena je na aluminijski držač uzoraka. Aluminij je, baš kao i svi metali, propusan za neutrone, ali očito ne za svijetlo ili X- zrake.

Marion Jasnin stavlja uzorak na kriostatski štap IN6 spektrometra. Kriostat kontrolira temperaturu uzorka za vrijeme prikupljanja podataka. Uzorak se nalazi u plosnatoj aluminijskoj kutiji na kraju štapa. Diskovi na štapu služe za zaštitu pomoću koje se održava stalna temperature na dnu kriostata Fotografija uz dopuštenje Giuseppea Zaccaia

Energija neutrona i brzina gibanja utvrđuju se prije i poslije raspršivanja mjerenjem njihove valne duljine (prema Ångströmovom spektru). Dvije su glavne metode (ovisno o spektrometru) korištene: „vrijeme leta“, u kojoj je brzina neutrona (obrnuto proporcionalna valnoj duljini, brzina je izražena u km/s za valne duljine prema Ångströmu) mjerena za određeni put; i ogib kristala (prema Braggovom zakonu samo određena valna duljina se ogiba za zadanu periodičnost rešetke i kutni razmještaj- više o ovom zakonu pročitajte u Hughes, 2007 i Cornuéjols, 2009). Doznajte više o ovim metodama na internet stranicama^w4.

Toplina je kretanje: brzina kojom se atomi u tvari kreću ovisi o temperaturi. Međutim, atomi u istoj tvari mogu se gibati različitom brzinom na istoj temperaturi ovisno o tome kako su vezani na druge atome oko njih: poznato je da su molekule vode usporene ako su u neposrednom dodiru s makromolekulama kao što su proteini ili DNA. Pitanje koje su znanstvenici postavili je: da li se stanična voda koja nije u direktnom kontaktu s makromolekulama kreće onako kao što bi se kretala u tekućoj vodi, ili se također znatno usporava?

Shema IN6 spektrometra za raspršivanje neutrona na ILLu Fotografija uz dopuštenje ILLa

Svaki neutronski spektrometar je specijaliziran za mjerenje atomskog kretanja unutar danog raspona valne duljine- prozor vremenske skale. U osnovi postoje tri tipa: oni čiji raspon iznosi oko 1 Ångström amplitude koja se događa u 1 pikosekundi (10-12 s), što odgovara toplinskom kretanju vodikovih atoma u tekućoj vodi na sobnoj temperature (napomena: to odgovara brzini od oko 100 m/s); oni čiji raspon iznosi od 1 do 10 Ångström amplituda u nanosekundama (10-9 s), koji bi pokupili “usporenu vodu”, i srednji tip za raspon od 1 do10 Ångström amplitude u 100 pikosekundi.

Koristeći spektrometar u pikosekundama i nanosekundama, Marion Jasnin i njezini suradnici ustanovili su da je dinamika vode u bakterijskoj stanici slična onoj u čistoj vodi. Molekule vode rotiraju i šire se linearno u tekućini, a izmjereno je blago usporenje rotacijskog širenja. Iz frakcije vodikovih atoma koji su se kretali sporije i prosječne površine makromolekula unutar stanice E. coli, znanstvenici su izračunali da ova frakcija odgovara jednom sloju molekula vode odmah do makromolekula koji je usporen, dok se ostale molekule vode kreću slobodno baš kao i u tekućoj vodi.

Ono što se događa unutar stanice je slično onome što je pronađeno oko otoka Venecijanske lagune u Italiji. Voda blizu makromolekula (otoka) je zadržana dok između molekula, gdje je samo jedan sloj vode do makromolekule ,voda ponovo dobiva svoju fluidnost. To je suprotno hipotezi o “ukroćenoj” vodi koja je tvrdila da je sva voda u stanici usporena. Nakon pokusa na E. coli, grupa je uspjela istražiti dinamiku vode u ljudskim crvenim krvnim stanicama na izvorima neutrona u Njemačkoj (FRM IIw5) i Švicarskoj (PSIw6). Potvrđeno je isto ponašanje kao i u E. coli, s tekućom vodom koja se slobodno struji izvan prvog sloja koji je u kontaktu s hemoglobinom, glavnim proteinom ovih stanica (Stadler et al., 2009). Znanstvenici mogu odahnuti- i nastaviti s pokusima u vodenim otopinama, zahvaljujući potvrdi da su ti pokusi valjani primjer onoga što se dešava u stanici.

Satelitska snimka Lagune Venecije, snimljena ASTERom (Advanced Spaceborne Thermal Emission and Reflection Radiometer, Napredni Svemirski Toplinski Misijski i Reflektirajući Radiometar), uređaj za snimanje smješten na Terri, satelitu koji je dio NASA Sustava za promatranje Zemlje ( NASA's Earth Observing System, (EOS) Javno dostupna slika; izvor slike: Wikimedia Commons

Referencije

Cicognani G (2006): Defying the laws of physics? Science in School 1: 19-21. www.scienceinschool.org/2006/issue1/defying

Cornuéjols D (2009): Biological crystals: at the interface between physics, chemistry and biology. Science in School 11: 70-76. www.scienceinschool.org/2009/issue11/crystallography

Hughes D (2007) Taking the stress out of engineering. Science in School 5: 61-65. www.scienceinschool.org/2007/issue5/stress

Jasnin M, Moulin M, Haertlein M, Zaccai G, Tehei M (2008) Down to atomic-scale intracellular water dynamics. EMBO Reports 9: 543-547. doi:10.1038/embor.2008.50

Stadler AM, Embs JP, Digel I, Artmann GM, Unruh T, Buldt G, Zaccai G (2008) Cytoplasmic water and hydration layer dynamics in human red blood cells. Journal of the American Chemical Society 130: 16852-16853. doi:10.1021/ja807691j

Tehei M, Franzetti B, Wood K, Gabel F, Fabiani E, Jasnin M, Zamponi M, Oesterhelt D, Zaccai G, Ginzburg M, Ginzburg BZ (2007) Neutron scattering reveals extremely slow cell water in a Dead Sea organism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104: 766-771. doi:10.1073/pnas.0601639104

Web referencije

w1 – Kako biste doznali više o Institutu Laue-Langevin, pogledajte: www.ill.eu

w2 – Kako biste doznali više o Institut de Biologie Structurale CEA-CNRS-UJF, pogledajte: www.ibs.fr

w3 – Doznajte više o ISIS, pulsirajućem izvoru neutrona i muona koji se nalazi u UK Rutherford Appleton Laboratory blizu Oxforda, ovdje: www.isis.rl.ac.uk

w4 – Za više informacija o ogibu neurona, kao i o tehnikama vremena leta i kristalnog ogiba, pogledajte na sljedećim stranicama Wikipedije:

http://tinyurl.com/yh436y4 za ogib neutrona,
http://tinyurl.com/ykywxht za neelastičan neutronski rasap,
http://tinyurl.com/yj4bnrf za vrijeme leta,
http://tinyurl.com/yfho9gz za kristalni ogib.

w5 – Doznajte više o Njemačkom izvoru neutrona za istraživanje FRM II (Forschungs-Neutronenquelle Heinz Maier-Leibnitz) u Munchenu na stranici: www.frm2.tum.de

w6 – Kako biste doznali više o Paul Scherrer Institute u Villingenu, Švicarska, pogledajte: www.psi.ch

Izvori

Životopis mlade istraživačice i njenog rada na halofilnim organizmima, pogledajte:

Leigh V (2008) Salt of the Earth. Science in School 8: 60-62. www.scienceinschool.org/2008/issue8/prudencemutowo

Ako ste uživali u članku te biste voljeli pročitati još neke tekstove o znanosti na ILLu u Science in School. Pogledajte: www.scienceinschool.org/ill

Giuseppe Zaccai je rođen u Aleksandriji, Egipat, te je u Aleksandriji i Rimu, Italija, pohađao škole na engleskom jeziku. Nakon doktorata iz fizike na Sveučilištu University of Edinburgh, UK, započeo je rad na biofizici u USA. Zatim je otišao na ILL, gdje je viši profesor za biologiju. Također je upravitelj istraživanja u Nacionalnom centru za znanstvena istraživanja Francuske (CNRS) te je od osnutka, 1992. godine, na čelu laboratorija molekularne biofizike na IBSu u Grenoblu.