Tercüme eden: Aslı Giray Kurt ve Hikmet Geckil (İnönü Üniversitesi, Biyoloji Bölümü, Malatya)

Protein kristalleri, çapı milimetreden daha küçük ve gelişimi zor olan küçük ve narin nesnelerdir. Oysa protein kristalleri, X ışınları ile analiz edilen yapısal biyolojik çalışmalar için gereklidir Resim, Gaby Sennhauser, University of Zürich izniyle

İsviçre Zürih Üniversitesi’nden Beat Blattmann ve Patrick Sticher, protein kristallografisinin temelini oluşturan bilimi açıklıyor ve bilim adamları tarafından protein yapılarını belirlemek için kullanılan bir protein kristallerinin büyütülmesi protokolü sunuyorlar. 1959 yılında, Max Perutz ve John Kendrew, balina hücrelerinde oksijen taşınımından sorumlu, küçük bir protein olan balina miyoglobininin üç boyutlu yapısı hakkında bir makale yayımladılar. Bu iki bilim adamı protein yapısının araştırılması ile ilgili olarak, moleküler düzeyde oksijen taşıma mekanizmasını anlamayı istiyorlardı. Araştırmacılar, proteinin kristallerini büyüttüler ve X ışını analizi ile kristalin kırınım motifine bağlı olarak yapısını belirlemeye çalıştılar.

Perutz ve Kendrew balina miyoglobin kristalleri ile kullanışlı kırınım motifini elde edene kadar, daha önce diğer türlerden bir dizi miyoglobini test etmişlerdi. Bu öncü çalışma, 1962^w1 yılında Kimya dalında Nobel Ödülü'ne layık görüldü. Ancak 50 yıl sonra bile, yapısal çalışmalar için protein kristalleri elde etmek hala önemli bir sorun olarak durmaktadır.

Proteinler nedir?

Proteinler canlı hücrelerde sulu olmayan bileşenlerin en büyük grubudur. Hemen her biyokimyasal reaksiyon, enzim olarak adlandırılan belirli bir protein gerektirir. Proteinlerin diğer tipleri mekanik ve yapısal (ör.,bağ dokusundaki kolajen) veya hücre sinyalini düzenlemede (ör., hormon reseptörleri) immün cevap (ör., antikorlar) ya da küçük moleküllerin taşınımı (ör., iyon kanalları) gibi işlevlere sahiptir. Bu çeşitlilik oldukça geniştir: sadece insanda 20,000’den fazla farklı proteinin var olduğu bilinmektedir.

Bu çeşitliliğe rağmen, tüm proteinler benzer bir yapısal prensibi paylaşırlar. Proteinler amino asit olarak adlandırılan 20 farklı yapıtaşından oluşurlar. Amino asitler birbirlerine kovalent bağlarla bağlanarak düz bir zincir oluştururlar (bkz. aşağıdaki Şekil). Protein zincirinin uzunluğu birkaç düzine amino asitten binlerce amino asite kadar olabilir. Hücrelerde her protein, ona karşılık gelen gelen gen tarafından kodlanır. Proteinin sentezi karmaşık bir moleküler makine olan, protein ve RNA’dan oluşan ribozom tarafından yapılır.

Proteinler kendilerine özgü üç boyutlu yapılara katlanırlar

Normal koşullar altında amino asitlerden oluşan lineer zincirler belli üç boyutlu yapılara kendiliğinden katlanırlar. Amino asitlerden oluşan zincirin belli bölgeleri karakteristik sekonder yapılı elementler oluştururlar. Bu elementler arasında en önemlileri tipik olarak amino asitler arasında hidrojen bağları ile kurulan α- heliks ve β- tabakalı yapılardır (bkz. aşağıdaki Şekil). Proteinin tamamı böyle çeşitli yapısal elementlerin oluşturduğu bir üçüncül (tersiyer) yapıyı oluşturur.

a. Proteinler düz bir zincir oluşturmak için birbirine kovalent olarak bağlanan amino asitlerden oluşur b. Proteinler, kendi işlevlerini belirleyen üç boyutlu bir yapıya katlanırlar. Amino asit zincirinin belli bölgeleri karakteristik katlanmalar gösterir. Bu katlanmalara iki önemli örnek α-heliksler ve β-tabakalarıdır. Image courtesy of Marc Leibundgut, ETH Zürich, and www.pdb.org

Büyütmek için resmin üzerini tıklayınız

Yapı, işlevdir: Bir proteinin üç boyutlu yapısı bize neyi anlatır?

Belli bir proteinin fonksiyonu onun üç boyutlu yapısına bağlıdır. Bir protein sadece katlandığında, proteinin belirli amino asitleri aktif bölgeyi oluşturacak şekilde biri birine yeterince yakın gelirler. Enzimlerde olduğu gibi bu bölgeler biyokimyasal reaksiyonları katalizleyebilir veya antikorlarda olduğu gibi spesifik bir bağlanma bölgesi oluşturabilirler. Yaşamın temel süreçlerinin moleküler seviyede nasıl işlediğini anlamak için bir proteinin yapısal detaylarının araştırılması büyük önem taşır: yapısal biyolojinin araştırma alanı budur. Bugün yapısal biyolojinin önemli hedeflerinden biri, büyük makromolekül komplekslerinin ve zar proteinlerinin etkileşim, yapı ve işlevlerinin aydınlatılmasıdır^w2. Karmaşıklıkları nedeniyle, bu proteinlerin deneysel olarak çalışılması ve yapılarının belirlenmesi son derece zordur. Bu tür bir işi yapmak her zaman büyük bir başarı olarak addedilmiştir. Ancak, bu kompleks proteinler temel biyolojik süreçlerde gerekli oldukları için, yapı ve fonksiyonlarının anlaşılması için bunlara büyük bir ilgi vardır ve bilim adamları bunları kristalize etmeyi denemeye devam etmektedirler.

X- ışını kırınımı ile protein yapı tayini için iş şeması
Resim, Beat Blattmann ve Patrick Sticher’in izniyle

Proteinler doğrudan gözlem için çok küçüktürler

Proteinler, yalnızca birkaç nanometre ile ölçülen (1 nm = 1x 10^-6 mm) küçük yapılardır, Bu parçacıklar bu boyutları ile 1 mikrometrelik maksimum çözünürlüğe sahip güçlü ışık mikroskobu ile bile gözlemlenemezler (1 mikron = 1x 10^-3 mm). Protein yapılarını 'görünür' yapmak için üç önemli teknoloji kullanılır:

• Protein kristallerinin X-ışını kırınımı
• Nükleer manyetik rezonans (NMR)
• Elektron kristalografisi

Halka açık biyolojik makromoleküllerin veritabanında^w3bulunan tüm proteinlerin %90’ından fazlasının yapısı X-ışını kırınımı ile belirlendiğinden, bu yöntem üzerinde özellikle duracağız. Kristallografinin tarihi hakkında daha fazla bilgi edinmek ve yapısı çözülene kadar bir laboratuvardan başka bir laboratuvara bir proteinin yolculuğunu öğrenmek için Dominique Cornuéjol’nun bu sayıdaki makalesine bakınız..

Proteinlerin kristalleşmesi oldukça hünerli bir iştir, çünkü her yeni proteini kristalize edecek uygun koşulları belirlemek zor olup hatta bazen imkansızdır. Böylece tekrarlanabilir kristal kalitesini sağlamak için (yani, aynı derecede iyi kristallerin tekrar büyütülmesi) bilim adamları kontrollü deneyler kurarlar. Protein kristalografisi içinde en sık kullanılan yöntem buhar difüzyon yöntemidir (bkz. Şekil): bu yöntemde, bir kristalizasyon solüsyonunun küçük bir miktarı rezervuarın kristalizasyon haznesine eklenir. Protein solüsyonu ve kristalizasyon solüsyonunun bir damlası bu haznenin merkezinde bulunan bir damlanın üzerine pipetlenir.

Buhar difüzyon yöntemi protein kristallerinin büyümesinde en sık kullanılan yöntemdir: a. Bir kristalizasyon solüsyonunun küçük bir miktarı küçük bir rezervuar içine konur. b. Protein solüsyonu ve kristalizasyon solüsyonunun bir damlası, haznede bulunan damlanın üzerine pipetlenir. c. Kristalizasyon işlemlini başlatmak için hazne kapatılır (mühürlenir)
Resim, Beat Blattmann ve Patrick Sticher’in izniyle

Tüm solüsyonlar ekledikten sonra buharlaşmayı önlemek için hazne mühürlenir. Kristalizasyon solüsyonunda tuz iyonlarının konsantrasyonu haznenin merkezinde bulunan damladakinden daha yüksek olduğu için, gaz fazında buhar difüzyonu ile çözücü (solvent) moleküller protein damlasından rezervuara doğru hareket ederler. Bu işlem sırasında, damladaki proteinin çözünürlüğü azalır. Sonunda aşırı doymuş hale gelen protein solüsyonu termodinamik olarak kararsız durumdur. Bu durum, damladaki proteinin bir kısmının sonuçta daha büyük kristallerle büyümesini sağlayan kristal çekirdeği oluşturmasına (bkz. Resim) veya X ışını analizinde kullanışsız amorf bir proteini çökeltisine neden olur. Kristalizasyon ve çöktürme birbiriyle yarış halinde olan süreçlerdir. Bu yüzden istenem kristalizasyonla sonuçlanacak optimal koşulları tespit etmek son derece önemlidir.

Kristaller aşırı doygunlukta olan sulu bir protein solüsyonu içinde gelişirler. Kristallendirme, iki fazda devam eder: çekirdeklenme ve büyüme. Çekirdeklenmeden sonra, düzenli büyük kristallerin büyümesi için en uygun koşuların olduğu “metakararlı zon” olarak bilinen noktaya ulaşmak önemlidir. Aşırı doymuş durumdaki protein konsantrasyonunu iki yarışmalı süreçle azaltır: (I) kristalizasyon, (II) çöktürme
Resim, Nicola Graf’ın izniyle

Ek öğretim materyali indiriniz

Powerpoint slayt, resim ve daha fazla deney çevirimiçi^w5 mevcuttur.

Malzeme tedarikçileri

Aşağıdaki tedarikçiler^w6 gerekli malzemeleri ve kimyasalları sağlar:

Hampton Araştırma:

• Cryschem™ 24-1 SBS plaka, Cat. No HR1-002 (Bu tür plaka kullanmanızı öneririz. Bir plakanın maliyeti yaklaşık olarak 3$ Amerikan doları).
• Kristal Şeffaflıkta Sızdırmaz Bant (5 cm), Cat. No HR4-51

Gilson Inc:

• 1 ml ve 1 μl pipetler

Sigma Aldrich:

• Lizozim, Ürün #62971
• Sodyum klorür, Ürün #71380
• Sitrik asit, Ürün #27488
• Sodyum asetat, Ürün #71190
• Sodyum fosfat, tek bazlı, Ürün #71502

Referanslar

Cornuéjols D (2009) Biological crystals: at the interface between physics, chemistry and biology. Science in School 11: 70-76. www.scienceinschool.org/2009/issue11/crystallography

Ağ üzerindeki referanslar

w1 – Kimya dalında 1962 Nobel ödüllü sahipleri ve onların öncü çalışmaları hakkında ek bilgi, Nobel Ödülü Komitesi web sitesinde bulunabilir: http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1962

w2 – İsviçre Araştırmada Mükemmeliyet Ulusal Merkezi (NCCR) Yapısal Biyoloji, zar proteinleri ve supra-moleküler komplekslerinin yapı-işlev ilişkilerinin aydınlatılmasına kendilerini adamış bilim adamlarının oluşturduğu bir topluluktur: www.structuralbiology.uzh.ch

Seçilmiş araştırma sonuçlarına buradan ulaşabilirsiniz: www.structuralbiology.uzh.ch/research004.asp

w3 – Biyolojik makromoleküllerin yapıları (proteinler ve nükleik asitlerin) Protein Veri Bankasında (PDB) mevcuttur. Web sitesi ilginç öğretim kaynakları sunmaktadır: www.pdb.org

Protein bilgileri için diğer değerli bir kaynak: www.proteopedia.org

w4 – Skype yüklemek ve kaydetmek için, bkz: www.skype.com

w5 – AEk ders kaynaklarına şu adresten ulaşabilirsiniz: www.structuralbiology.uzh.ch / teacher: www.structuralbiology.uzh.ch/teacher

Login: crystallization
Password: xraybeam2008

This site will be updated regularly.

w6 – malzeme tedarikçilerinin web siteleri aşağıdaki gibidir:

Hampton Araştırma: www.Hamptonresearch.com
Gilson Inc.: www.gilson.com
Sigma-Aldrich: www.sigmaaldrich.com

Kaynaklar

Abad-Zapatero C (2002) Crystals and Life: A Personal Journey. La Jolla, CA, USA: International University Line. ISBN: 978-0972077408

Burada, daha genç öğrencilere protein olmayan kristalleri büyütmek için önerilen bazı protokoller:

www.msm.cam.ac.uk/phase-trans/2002/crystal/a.html www.waynesthisandthat.com/crystals.htm http://chemistry.about.com/od/growingcrystals/Growing_Crystals.htm

---

Beat Blattmann NCCR Yapısal Biyoloji’de yüksek verimlilik kristalizasyon tesisinden sorumlu bir kimyagerdir. Bu sistem her gün 5000 kristalizasyon şartı için test imkânı sağlar.

Patrick Sticher mikrobiyoloji alanında doktora yapmış olup NCCR’nin bilim yetkilisidir ve eğitim, teknoloji transferi ve program koordinasyonunundan sorumludur.