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Home » Issue 9 » Investigando a acção da urease

Investigando a acção da urease

Traduzido por Artur Melo


Imagem cortesia de Alamy

Anna Lorenc do projecto Volvox explica a importância da enzima urease e apresenta um protocolo para demonstrar a actividade da urease, em sala de aula.

As enzimas desempenham um papel essencial no metabolismo de todos os organismos. Catalisam e controlam a maior parte das reacções químicas no nosso corpo – desde a replicação da informação genética (DNA polimerase) à digestão. A actividade enzimática nem sempre é, no entanto, fácil de visualizar. Este é um protocolo simples e barato para auxiliar o ensino do tema ‘actividade enzimática’, em sala de aula. Todos os materiais necessários são fáceis de obter e seguros.

Nesta investigação, a enzima urease dos feijões de soja (Glycine max) desdobra a ureia em amónia e dióxido de carbono:

CO(NH2)2 + H2O → 2 NH3 + CO2

A solução de amónia (NH3) tem um pH elevado que pode ser determinado com um indicador de pH vulgar, tal como o que se pode extrair da couve-roxa. A amónia produzida na reacção pode também ser detectada pelo seu odor.

Como a urease é produzida por uma larga variedade de organismos, esta actividade prática pode ser utilizada em aulas sobre:

  • Ciclo do azoto
  • Influência dos organismos no seu meio ambiente
  • Adaptação dos animais a diversas dietas.

Base teórica do protocolo

O que é a ureia?

Todos os organismos decompõem ácidos nucleicos e proteínas produzindo resíduos azotados, pois os ácidos nucleicos e as proteínas contêm azoto. Os mamíferos, anfíbios e alguns invertebrados libertam resíduos azotados na forma de ureia, que é produzida no fígado. A ureia é um composto especialmente indicado para a eliminação de azoto, pois é solúvel em água e menos tóxica que a amónia - que é o produto da excreção nos peixes, por exemplo. A urina humana contém 2% de ureia.

A ureia foi, também, o primeiro composto orgânico a ser sintetizado. Em 1828, Friedrich Wöhler sintetizou ureia a partir de compostos inorgânicos (cianato de chumbo e hidróxido de amónia). Foi um acontecimento de referência: até então acreditava-se que apenas os seres vivos eram capazes de produzir compostos orgânicos, e achava-se que estes compostos eram especiais, sendo necessária uma 'força vital' para os sintetizar. Wöhler estabeleceu a ligação entre o mundo dos seres vivos e o dos seres não vivos. Não recebeu, no entanto, um Prémio Nobel pela sua descoberta, porque esse prémio ainda não existia. Hoje, a ureia é sintetizada em enormes quantidades: é usada no fabrico de plásticos e como fertilizante azotado barato.

O que é a urease?

A urease catalisa a hidrólise de ureia em dióxido de carbono e amónia. Encontra-se principalmente em sementes, microrganismos e invertebrados. Nas plantas, a urease é um hexâmero – consiste em seis cadeias idênticas – e localiza-se no citoplasma. Em bactérias, é constituída por duas ou três subunidades diferentes. Para ser activada, a urease precisa ligar-se a dois iões níquel por subunidade.

Como se tornou a urease famosa?

A urease de feijões-sabre (Canavalia ensiformis) foi a primeira enzima a ser purificada e cristalizada, um feito de James B. Sumner em 1926, numa altura em que a maior parte dos cientistas acreditava ser impossível cristalizar enzimas. Este feito valeu-lhe, em 1946, o Prémio Nobel da Química. Actualmente, a cristalização de proteínas ajuda os cientistas a determinar a sua estrutura e a saber como funcionam. Este conhecimento permite a criação de substâncias que interferem com a acção enzimática, tais como medicamentos anti-SIDA que inibem a acção das enzimas do HIV ou os desenvolvimentos recentes com vista a um possível tratamento para a raiva (Ainsworth, 2008).

Porque existe urease nos feijões de soja?

O papel da urease nos feijões de soja não é completamente claro, apesar de podermos especular. As folhas de soja também contêm urease, mas nelas a enzima é mil vezes menos activa que nos feijões. Sabe-se que a enzima das folhas ajuda a reciclar o azoto presente nas proteínas (as proteínas são transformadas em ureia). Nos feijões, a urease faz o mesmo durante a germinação. A amónia que resulta da reacção pode também proteger as células da planta de agentes patogénicos - parece que a própria enzima da planta é um insecticida.


A planta de soja
Imagem cortesia de iStockphoto

Onde mais podemos encontrar a urease?


Helicobacter pylori
Imagem cortesia de iStockphoto

Muitas espécies de bactérias produzem urease, incluindo Helicobacter pylori, a bactéria responsável pelas úlceras do estômago. Ao fazer isto, H. pylori eleva o pH do suco gástrico de aprox. pH 3 para pH 7, o pH óptimo para se desenvolverem. Um teste para H. pylori disponível no mercado verifica a presença de urease no ar expirado, sendo usado como diagnóstico de úlceras estomacais.

Os ruminantes (tal como vacas e ovelhas) possuem bactérias que digerem celulose na sua pança - o primeiro compartimento do estômago - para os ajudar a digerir a dieta vegetal. Os ruminantes libertam ureia nesta região do estômago, constituindo a ureia uma excelente fonte de azoto para o crescimento de bactérias. Para captar o azoto, as bactérias segregam urease para decompor a ureia. Eventualmente, os animais digerem a massa de bactérias.

Será a urease da soja prejudicial para os seres humanos?

A urease não é perigosa. No entanto, o feijão de soja cru contém outros compostos que não são saudáveis. Por exemplo, existe um inibidor proteico no feijão de soja cru que impede a enzima digestiva tripsina de tornar os feijões de soja comestíveis. A presença do inibidor não é fácil de detectar, mas felizmente possui um nível semelhante de intolerância ao calor que a urease - ambos são inactivados pelo calor. Por isso, para assegurar que o inibidor é desactivado, produtos de feijão de soja (farinha de soja ou alimentos que contêm soja, tais como 'tempe' e 'tofu') são testados relativamente à actividade da urease - de forma semelhante ao teste aqui descrito. Se não for detectada qualquer actividade da urease, o inibidor também foi presumivelmente desactivado.

Urease no ciclo do azoto

O azoto é um elemento crucial para o crescimento das plantas, mas a maior parte delas apenas consegue usá-lo na forma de amónio ou nitrato. Apenas as leguminosas (graças às bactérias com as quais vivem em simbiose) e as cianobactérias conseguem usar azoto elementar atmosférico.

Muitos animais libertam ureia através da urina. Os microrganismos do solo alimentam-se da urina animal, produzindo urease para transformar a ureia em amónia, que fica assim acessível para as plantas. Esta é uma parte do ciclo do azoto, o processo pelo qual o azoto das proteínas e outros compostos é constantemente reciclado.

O protocolo

Este protocolo permite aos alunos detectar a actividade de uma enzima vegetal das sementes. Quando o substrato (ureia) está presente, a urease desdobra-o em dióxido de carbono e amónia. Dissolvida em água, a amónia eleva o pH, um efeito observável com o indicador de pH da couve-roxa. Na experiência, os alunos verificam que para obter o produto (amónia), são necessários tanto o substrato (ureia) como a enzima (urease). Observam que a actividade da enzima aumenta o pH.

Extracto de couve-roxa – um óptimo indicador de pH

Neste protocolo, usamos extracto de couve-roxa como indicador de pH. Ele contém antocianinas. A estrutura e a cor (em solução) destes compostos são sensíveis ao pH. A pH 7, a solução é violeta/azul; no intervalo ácido de pH fica vermelho. Quando o pH é superior a 7, e a solução é mais alcalina, o extracto fica verde. Estas alterações de cor são reversíveis - basta ver o que acontece quando juntamos ácido cítrico e em seguida soda (bicarbonato de sódio).

Materiais e equipamento

Para cada aluno ou grupo de alunos:

  • 20 ml de solução 10% de ureia fertilizante (um fertilizante sólido constituído por ureia pura)
  • 5 ml de solução 10% de ácido cítrico (ou outra solução de pH baixo)
  • 5 ml de solução 10% de bicarbonato de sódio (NaHCO3) (ou outra solução de pH elevado)
  • 40 ml de indicador de couve-roxa, preparado como se descreve a seguir
  • 10 ml de extracto de feijão de soja, preparado como se descreve a seguir (a partir de 1 g de feijão de soja seco)
  • 10 ml de água destilada
  • pipetas de Pasteur ou palhinhas de plástico, para transferir as soluções
  • 6 tubos de ensaio e um suporte para tubos.

Para preparar o extracto de soja e o indicador de couve-roxa, é necessário um misturador e água a ferver, assim como filtro de café e um funil.

Tempo de preparação

A experiência pode ser concluída em 30 minutos.

A suspensão de feijões de soja e o extracto de couve-roxa podem ser feitos antecipadamente, ou a sua preparação pode ser demonstrada durante a aula. Demora apenas dez minutos, mas tenha em atenção que os feijões de soja devem ser embebidos em água durante pelo menos uma hora antes da aula.

A reacção entre a urease da soja e a ureia também demora cerca de dez minutos.

Preparação

Indicador de couve-roxa

  1. Cortar duas folhas grandes de couve-roxa em tiras e colocá-las num recipiente resistente ao calor, p. ex. um gobelé. Despejar 200 ml de água a ferver, mergulhando completamente as folhas.
  2. Após 5 minutos, decantar o liquido e deixar arrefecer.
  3. Colocar as folhas de lado.
Imagem cortesia de Dean Madden

Extracto de feijão de soja com urease

  1. Mergulhar os feijões de soja em água durante pelo menos 1 h (de preferência durante a noite).
  2. Misturar os feijões de soja embebidos num misturador, com cerca de 10 ml de água por grama de soja seca (a água de embeber os feijões pode ser usada) até a mistura estar cremosa (durante cerca de 5 minutos).
  3. Filtrar o puré de soja através de um papel de filtro num funil.
  4. Recolher e guardar o filtrado, que contém urease.
Imagem cortesia de Dean Madden

Investigação

Os volumes indicados a seguir são para tubos de ensaio de vidro standard (~10 ml).

Primeiro pedir aos alunos que verifiquem como o pH influencia a cor do extracto de couve-roxa.

  1. Colocar 3 ml de indicador de couve-roxa em cada um de três tubos.
  2. Juntar 2 gotas de solução de ácido cítrico ao primeiro tubo de ensaio. Agitar e observar a alteração da cor. Enxaguar a pipeta com água após a adição de cada componente.
  3. Juntar 2 gotas de solução de bicarbonato de sódio ao segundo tubo de ensaio. Agitar e observar a alteração da cor.
  4. Juntar 2 gotas de água destilada ao terceiro tubo de ensaio. Agitar e observar a alteração da cor.
  5. Comparar e registar as cores das soluções nos três tubos de ensaio. Guardar os tubos para servirem como referência (controlo).

Em seguida, investigue o efeito da urease do feijão de soja sobre a ureia.

  1. Colocar 2 ml de indicador de couve-roxa em cada um de três tubos de ensaio.
  2. Adicionar 2 ml de solução de ureia a cada um de dois tubos de ensaio. Registar a cor.
  3. Adicionar 2 ml de suspensão de soja ao terceiro tubo e a um dos tubos com solução de ureia.
  4. Comparar as cores e os odores das misturas em todos os tubos. Repetir esta observação três minutos depois.

Interpretação

O indicador de couve-roxa fica verde quando o pH aumenta. Esta alteração de cor, em conjunto com o odor a amónia, pode ser detectada num tubo com a enzima e o seu substrato. Nos tubos que contêm apenas a enzima ou o substrato, o pH mantém-se estável e, por isso, o indicador de couve-roxa continua violeta.

Segurança

Aproximadamente 1% das crianças podem ser alérgicas ao extracto de feijão de soja (ver McGee, 2004). Aconselha-se que os professores se assegurem que nenhum dos alunos é afectado antes de usar este protocolo.

Investigações adicionais

Uma experiência complementar poderia ser realizada para investigar os factores que influenciam a actividade enzimática (tais como a temperatura, pH e as concentrações de enzima, substrato e produto).

Agradecimentos

Este protocolo experimental foi elaborado por Anna Lorenc do projecto Volvox, criado pelo 'Sixth Framework Programme' da Comissão Europeia.

O projecto Volvox

A equipa do projecto Volvox é um grupo de professores de biologia e especialistas de dez países da União Europeia, que visa fornecer aos professores de biologia do ensino secundário e outros, protocolos laboratoriais, simulações e actividades de sala de aula comprovadas e numerosos outros recursos educacionais. Ver www.eurovolvox.org

Opinião

A actividade enzimática é frequentemente investigada através da acção da amilase sobre o amido, estabelecendo ligação com a alimentação e a nutrição. O método simples aqui apresentado constitui uma boa alternativa, com ligação ao ciclo do azoto, o qual pode ser um conceito difícil para os alunos compreenderem. A ideia de usar um indicador natural, que pode ser isolado pelos alunos, torna a aula mais divertida. Além disso, os alunos podem cheirar o produto da reacção devido à libertação de amónia! Os factores que influenciam a actividade enzimática poderiam ser investigados como trabalho de grupo, discutido numa sessão plenária.

O artigo poderia ser usado para verificar a compreensão colocando questões como:

  • Porque são as folhas de couve colocadas em água a ferver?
  • Para que cor muda o indicador se a amónia estiver presente na solução?
  • Descreva o que observaria se tivesse usado extracto de feijão de soja fervido e justifique essa observação.
  • Indique qual dos tubos de ensaio é o tubo controle da experiência. Explique o isso significa e o que esperaria observar neste tubo.

Shelley Goodman, Reino Unido

Referências

Ainsworth C (2008) Locking the cradle. Science in School 8: 25-28. www.scienceinschool.org/2008/issue8/rabies

McGee H (2004) On food and cooking. London, UK: Hodder & Stoughton. ISBN: 0340831499

Fontes

Sirko A, Brodzik R (2000) Plant ureases: roles and regulation. Acta Biochim Polonica 47(4): 1189-1195

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