Preveo Marinko Petković

Slika dobijena ljubaznošću iStockphoto

Fred Engelbrecht i Tomas Wendt iz Nastavno-istraživačke laboratorije EksploHajdelberg u Hajdelbergu opisuje nekoliko eksperimenata u otkrivanju šećera kako bi ukazali probleme sa kojima se svakodnevno sreću osobe sa dijabetesom.

Dijabetes, bolest moderne civilizacije

Monosaharid glukoza je najvažniji izvor energije u živim ćelijama eukariota i ćelije ga koriste u aerobnom ili anaerobnom disanju. Takođe služi i kao prekursor u sintezi proteina i u metabolizmu lipida. Iz tog razloga, glukoza je centralni molekul u nekoliko metaboličkih puteva i koncentracija u krvotoku je strogo kontrolisana prisustvom insulina i glukagona.

Dijabetes melitus (ili jednostavno dijabetes) je sindrom okarakterisan kao poremećaj metabolizma glukoze i visokog nivoa šećera u krvi (hiperglikemija). Ovo nastaje bilo kao posledica niskog nivoa insulina ili kao patološka otpornost insulina u odnosu na nivo sekrecije, koja je toliko niska da se otpornost može kompenzovati.

Postoje dva osnovna oblika dijabetesa: Tip 1 i Tip 2. Iako imaju različite uzroke, pacijenti sa bilo kojim oblikom nemaju mogućnost stvaranja dovoljne količine insulina u beta-ćelijama pankreasa i na taj način spreče pojavu hiperglikemije.

Tip 1 dijabetesa je zastupljen u oko 10% svih slučajeva dijabetesa u Evropi i karakteriše ga nedostatak beta-ćelija pankreasa najčešće prouzrokovane autoimunom destrukcijom. Kako se Tip 1 dijabetesa najčešće pogađa pacijente u ranim godinama života, te se iz tog razloga naziva još i juvenilni dijabetes. To je veoma težak oblik bolesti jer ne postoji način lečenja. Umesto toga, pacijenti moraju prilagoditi svoje životne navike, kao na primer uvođenje dijetalnog režima ishrane, svakodnevne vežbe i redovno praćenje nivoa šećera u krvi. Dodatno moraju obavezno ubrizgavati potkožno ili kontinuirano pomoću pumpica insulin u krvotok kako bi izbegli komu ili smrt.

Tip 2 dijabetesa nastaje usled otpornosti insulina ili smanjenja osetljivosti insulina u tkivima kombinovano sa smanjenom sekrecijom insulina. Slaba osetljivost tkiva na insulin skoro uvek izaziva povećanje insulin receptora na membranama ćelija. Ovo ima za uzrok da organizam traži ekstremno visok nivo insulina, kako bi održao normalni nivo šećera u krvi, a dijabetes se razvija kada beta-ćelije pankreasa taj zahtev ne mogu ispuniti. Tip 2 dijabetesa često je poznatiji kao adultni ili starački dijabetes, koji se najčešće javlja posle 30 godine života. U većini slučajeva, često je udružen sa gojaznošću i ekstremnom fizičkom neaktivnošću; uvođenjem zdravog režima života može se stanje poboljšati ili u nekim slučajevima i potpuno izlečiti. Pogledajte Dugi (2006) za više detalja dijabetesa.

Osobe pogođene bilo kojim tipom dijabetesa trebaju da nauče kako da žive sa simptomima bolesti. To uključuje često mokrenje, pojačan osećaj žeđi i prema tome povećan unos tečnosti u organizam. Kako je veliki broj dece pogođen dijabetesom, neophodno je sa učenicima raditi u najranijim fazama. Oboleli od dijabetesa trebaju znati, kako da umanje svoje simptome ili čak spreče pojavu bolesti uzimanjem propisane dijetalne hrane i redovim vežbanjem. Zdrava deca trebaju da shvate potrebe svojih obolelih vršnjaka.

Slika dobijena ljubaznošću iStockphoto

Mi smo iz tog razloga pripremili nekoliko ogleda da bi osposobili učenika da otkriju ugljene hidrate. Prva serija ogleda otkriva da li rastvori sadrže skrob, proteine ili šećere kao što su glukoza, laktoza ili sukroza ili ne. Kada se šećeri otkriju, sledeći ogledi dokazuju koji uzorci sadrže laktozu ili glukoza, korišćenjem specifičnih enzimskih reakcija. Princip ovih ogleda je isti kao i u analizama za određivanje nivoa šećera u krvi u dijagnostikovanju dijabetesa, ili određivanja nivoa glukoze i/ili laktoze, na primer u voćnim sokovima, mleku i mlečnim proizvodima. Ovi ogledi, prema tome, navode učenike na ideju kako oboleli od dijabetesa mogu pratiti nivo šećera.

Ogled 1: Otkrivanje šećera, skroba i proteina

Učenici dobijaju pet uzoraka, označeni sa slovima A do E, koji sadrže skrob, proteine (goveđi serumski albumini), monosaharid glukozu, disaharide laktozu i sukrozu. Svi rastvori su vodeni u koncetraciji od 0,1%. Takođe se preporučuje za testiranje bezbojni rastvor koji sadrži glukozu, energetsko piće (npr. Powerade®-Lemon). Učenici bi trebali da pomoću različitih reagenasa odrede koji uzorci sadrže šećer, skrob ili proteine.

Za razred od 30 učenika za rad u parovima potrebni su sledeći rastvori:

• Svež Felingov reagens, napravljen mešanjem jednakih količina svetlo plavog rastvora Felinga I (7g CuSO₄·5H₂O rastvorenog u 100ml destilovane vode) i bezbojnog rastvora Felinga II (35g C₄H₄KNaO₆ ·4H₂O i 10g NaOH rastvorenog u 100 ml destilovane vode). Rastvor se treba pripremiti neposredno pre upotrebe.


• Lugolov rastvor, koji se pravi rastvaranjem 1g joda (I₂) i 2g kalijum jodida (KI) u 50ml destilovane vode.


• Komasi brilijant plavo, boja za Bredfordovu reakciju. Ovaj reagens se može kupiti gotov na tržištu, ili rastvoriti čistu supstancu prema uputstvu^w1.

a) Određivanje redukujućih šećera (Felingova reakcija)

1. Odmeriti po 1ml rastvora u pet epruveta označene slovima A do E. Epruvete zagrevati u vodenom kupatilu 2 minuta na 60°C.
2. Dodati po 16 μl sveže pripremljenog Felingovog rastvora u svaku epruvetu nastaviti i sa inkubacijom na 60°C narednih 10 minuta ili sve dok se ne primeti bojena reakcija i pojava taloga.

Rastvori koji sadrže redukujuće šećere kao što su fruktoza, glukoza i laktoza daju crvenu boju i crveni talog (rastvorni bakar (II) joni se redukuju i prelaze u nerastvorni bakar (I) oksid). U epruvetama gde nema razvoja boje su ostali sukroza ili skrob. Uzorak proteina daje slabo ljubičastu boju.

b) Određivanje skroba (Lugolov rastvor)

1. Pipetom odmeriti po 500μl uzoraka u obeležene epruvete A do E.
2. Dodati po 50μl Lugolovog rastvora u svaku epruvetu i posmatrati boju reakcije.

Lugolov rastvor je dokazni reagens za prisustvo skroba. Jod će obojiti skrob iz razloga što reaguje sa helikoidalnom strukturom polisaharida, stvarajući tamno plavu boju. Sa monosaharidima (glukoza) ili disaharidima (laktoza i sukroza) neće dati pozitivnu reakciju.

c) Određivanje proteina

Set za određivanje proteina se zasniva na Bredfordovom reakciji gde se meri promena boje Komasi brilijant plavog koji se veže za proteine.

1. Pipetom odmeriti po 20μl uzoraka rastvora u pet novih epruveta. Dodati po 800μl dejonizovane vode i 200μl komasi brilijant plavog (Bredfordovog reagensa).
2. Promešati smešu i ostaviti 5 minuta na sobnoj temperaturi i posmatrati reakciju.

Prisustvo proteina će promeniti boju smeše u plavo (može se meriti pomoću fotometra na 595 nm). Uzorci koji sadrže šećer ili skrob neće dati pozitivnu reakciju.

Mere zaštite: Komercijalni set za određivanje proteina sadrži metanol i fosfornu kiselinu te se mora pažljivo rukovati sa njim.

Rezultati i tumačenje

Rastvor B daje pozitivnu reakciju sa Lugolovim rastvorom. Rastvor D daje pozitivni rezultat sa Brefordovim reagensom čime se dokazuje da je to rastvor proteina. Rastvori A i C daju crveni talog u toku Felingove reakcije i na taj način se identifikuju kao uzorci sa redukujućim šećerima kao što su glukoza i laktoza (mada u ovom trenutku se ne može reći gde je koji). Preostali rastvor E ne pokazuje pozitivne reakcije ni sa jednim reagensom te se može tvrditi da je to rastvor sukroze.

Eksperiment 2: Enzimsko određivanje šećera

U drugom eksperimentu, analiziraju se rastvori A i C, kako bi se odredio sadržaj odnosno prisustvo laktoze i glukoze. U ovom eksperimentu se upotrebljava komercijalni set za enzimsko određivanje laktoze /D-glukoze^w2. Postupak je sličan rutinskom određivanju nivoa glukoze u krvi kod obolelih od dijabetesa. Standardna procedura određivanja je modifikovana i umanjena, tako da se može načiniti veliki broj eksperimenata sa dostupnim reagensom. Jedan set omogućuje dovoljno materijala za 20 parova učenika.

Princip određivanje je sledeć:

• Enzim β-galaktozidaza vrši hidrolizu disaharida laktoze pri čemu nastaje D-galaktoza i D-glukoza (korak 1).


• U prisustvu ATP, D-glukoza se fosforiliše u prisustvu enzima heksokinaze u glukozu-6-fosfat; istovremeno dolazi do stvaranja adenozin-5’-difosfata (ADP) (korak 2).


• Glukoza-6-fosfat se oksiduje u prisustvu glukoza-6-fosfat dehidrogenaze u glukonat-6-fosfat.


• U toku reakcije prisutni NADP⁺ se redukuje do NADPH. Količina  NADPH nastala u ovoj reakciji je u direktnoj proporcionalnosti sa količinom laktoze i može se fotometrijski meriti promena apsorpcije na 340nm.

Text

Za pripremu reakcije potrebno je:

1. U četiri mikro epruvete obeležene sa A+, A-, C+ i C-, dodati po 100 µl pufera (fosfatni pufer pH 6.6) u svaku epruvetu i po 5 µl b-galaktozidaze u epruvete označene sa A+ i C+ (enzim ne dodavati u epruvete obeležene sa A- i C-).
2. Dodati po 100µl uzorka A u epruvete obeležene sa A+ i A- i 100µl uzorka C u epruvete C+ i C-.

Pažnja: Naredni koraci ovog eksperimenta su identični za sve test epruvete.

1. Epruvete inkubirati 30 minuta na 37°C u vodenom kupatilu kako bi laktoza hidrolizovala.
2. Nakon inkubacije dodati u svaku epruvetu po 1ml destilovane vode, 200µl reagensa R1 i 50 µl reagensa 2 (koji sadrži ATP i NADP, respektivno) i lagano promešati.
3. Posle inkubacije od 2 minuta prebaciti po1 ml reakcionih smeša u kivete i meriti apsorbancu na 340 nm (OD₃₄₀), prema slepoj probi.
4. U svaku kivetu dodati po 7 µl R3 reagensa koji sadrži heksokinazu i glukoza-6-fosfat-dehidrogenazu i meriti absorbancu na 340 nm.

Rezultati i tumačenje

Sva četiri uzorka pokazuju niske vrednosti apsorpcije u toku prvog merenja, iz razloga što NADPH nije prisutan u reakcionoj smeši. U toku drugog merenja (nakon dodatka enzima) uzorci A i C pokazuju razliku. Kako uzorak A daje pozitivan rezultat nezavisno od toga da li je dodat b-galaktozidaza u smešu, može se zaključiti da uzorak sadrži glukozu. U odnosu na uzorak C, gde su promena absorpcije može primetiti samo nakon dodatka b-galaktozidaze (C+), dolazi se do zaključka da je u uzorku C laktoza.

U toku praktičnog rada učenici dobijaju osnovne informacije o dijabetesu i problemima sa kojima se sreću osobe sa dijabetesom. Kako bi pratili nivo glukoze u krvi, oboleli koriste test trake pomoću kojih se uzorak krvi testira na istom principu kao i u toku eksperimenta 2. Eksperiment ovog tipa može povećati obaveštenost o dijabetesu, te na koji način se može sa dijabetesom živeti ili čak sprečiti promenom načina života.

Eksperimenti ovde opisani se mogu bezbedno izvoditi u školskim laboratorijama, jer reagensi , koji se upotrebljavaju, nisu opasne materije u skladu sa Regulativom o opasnim materijama (EC Regulation 67/548/EEC). Nivo natrijum azida, koji se koristi kao konzervans reagensa, je ispod najnižeg nivoa toksičnosti, prema Direktivi 1999/45/EC.

Literatura

Dugi K (2006) Diabetes mellitus. Science in School 1: 61-65. www.scienceinschool.org/2006/issue1/diabetes

Internet literatura

w1 – Biorad: www.bio-rad.com

w2 – BioControl: www.rapidmethods.com

w3 – ExploHeidelberg: www.explo-heidelberg.de

w4 – University of Education Heidelberg: www.ph-heidelberg.de