Traduzido por Artur Melo

Imagem cortesia de iStockphoto

Fred Engelbrecht e Thomas Wendt do ExploHeidelberg Teaching Lab descrevem algumas experiências sobre detecção de açúcar para demonstrar os problemas que as pessoas com diabetes enfrentam diariamente.

Diabetes, uma doença da civilização moderna

O monossacarídeo glicose é a mais importante fonte de energia para os organismos eucarióticos actuais e é usado pelas células na respiração aeróbia ou anaeróbia. Também age como precursor na produção de proteínas e no metabolismo de lípidos. Por isso, é uma molécula fundamental em várias vias metabólicas e a sua concentração na corrente sanguínea deve ser rigorosamente regulada pela insulina e pelo glucagon.

Diabetes mellitus (ou simplesmente diabetes) é uma síndrome caracterizada por metabolismo da glicose descontrolado e níveis de açúcar no sangue demasiado elevados (hiperglicémia). Isto deve-se tanto a níveis baixos da hormona insulina como a uma resistência anormal ao efeito da insulina em conjunto com níveis de secreção de insulina que são demasiado baixos para compensar a resistência.

Há duas formas principais de diabetes: Tipo 1 e Tipo 2. Apesar de terem causas diferentes, os pacientes de ambas os tipos são incapazes de produzir insulina suficiente nas células beta do pâncreas para evitar a hiperglicémia.

A diabetes tipo 1 inclui cerca de 10% dos casos de diabetes na Europa, e caracteriza-se pela perda de células beta do pâncreas, normalmente por destruição auto-imune. Como a diabetes tipo 1 afecta frequentemente pacientes ainda jovens, também é conhecida por diabetes juvenil. É a forma mais grave da doença porque não tem cura. Em vez disso, os doentes devem ajustar o seu estilo de vida, por exemplo melhorando a sua dieta, fazendo exercício regularmente e monitorizando os seus níveis de açúcar no sangue. Adicionalmente, são necessárias injecções subcutâneas ou o fornecimento contínuo de insulina, com uma bomba, para o sistema de circulação sanguínea, para evitar o coma ou a morte.

A diabetes tipo 2 deve-se à resistência à insulina ou a uma sensibilidade à insulina reduzida nos tecidos alvo, em combinação com secreção insuficiente de insulina. A resposta diminuída dos tecidos corporais à insulina envolve certamente os receptores de insulina nas membranas celulares. Em consequência, o corpo precisa de quantidades de insulina anormalmente altas para manter os níveis de açúcar no sangue normais, e a diabetes desenvolve-se quando as células beta não conseguem fazer o que lhes é pedido. A diabetes tipo 2, conhecida vulgarmente por diabetes do adulto, aparece normalmente após os 30 anos de idade. Na maior parte dos casos, está ligada à obesidade e ao pouco exercício físico; a mudança para um estilo de vida mais saudável pode melhorar a situação ou mesmo, em alguns casos, curá-la. Ver Dugi (2006) para mais detalhes sobre a diabetes.

Pessoas afectadas por qualquer um dos tipos de diabetes precisam de aprender a viver com os sintomas da doença. Estes incluem urinar frequentemente, aumento da sensação de sede e, consequentemente, aumento da ingestão de líquidos. Como um elevado número de crianças é afectado pela diabetes, é essencial ensinar os alunos acerca da doença desde muito jovens. Quem sofre de diabetes precisa de aprender a minimizar os sintomas ou mesmo evitar a doença ingerindo uma dieta saudável e fazendo exercício suficiente. Crianças saudáveis deveriam perceber as necessidades dos seus amigos afectados.

Imagem cortesia de iStockphoto

Juntámos, portanto, algumas experiências para permitir aos alunos a detecção de hidratos de carbono. Uma série de experiências detecta se uma solução contém, ou não, amido, proteínas ou açúcares tais como a glicose, lactose ou sacarose. Após a identificação dos açúcares, experiências adicionais determinam, através de uma reacção enzimática, quais as amostras que contêm lactose ou glicose. O princípio destas experiências é o mesmo que o das análises para determinar os níveis de glicose no sangue, ou para medir os níveis de glicose e/ou lactose, por exemplo, em sumos de fruta, leite ou produtos lácteos. Estas experiências fornecem assim, aos alunos, uma visão de como os doentes com diabetes podem monitorizar os seus níveis de açúcar.

Experiência 1: Detecção de açúcar, amido e proteína

Os alunos recebem cinco amostras, rotuladas de A a E, que contêm amido, proteína (albumina de soro bovino), o monossacarídeo glicose, ou os dissacarídeos lactose e sacarose. A concentração de todas as soluções é 0.1% em água. Também podemos testar amostras de bebidas energéticas incolores contendo glicose (p.ex. Powerade®-Limão). Usando várias soluções de reagentes, os alunos deverão determinar qual das cinco amostras contém açúcar, amido ou proteína.

Para uma turma de 30 alunos, em grupos de dois, irá precisar das seguintes soluções:

• Solução de Fehling recente, constituída pela mistura, em partes iguais, de solução Fehling I azul clara (7 g CuSO₄·5H₂O dissolvido em 100 ml de água destilada) e solução Fehling II incolor (35 g C₄H₄KNaO₆·4H₂O e 10 g NaOH dissolvidos em 100 ml de água destilada). A solução deve ser misturada pouco antes da sua utilização.


• Soluto de Lugol, dissolvendo 1g de iodo 1 g iodine (I₂) e 2 g de iodeto de potássio (KI) em 50 ml de água destilada.


• Corante Azul Brilhante de Coomassie para o ensaio de Bradford que pode ser adquirido, por exemplo, na Biorad^w1.

a) Detecção de um açúcar redutor (reacção de Fehling)

1. Pipetar uma amostra de 1ml de cada uma das soluções A a E para tubos de ensaio diferentes e aquecer o conteúdo até 60 ºC em banho-maria durante 2 minutos.
2. Adicionar 16 μl de solução de Fehling azul escura a cada tubo de ensaio e incubar os tubos a 60 ºC durante mais 10 minutos, ou até se observar uma reacção colorida e a formação de precipitado.

As soluções que contêm açúcares redutores como frutose, glicose ou lactose deverão ficar avermelhadas e formar um precipitado da mesma cor (os iões cobre (II) dissolvidos são reduzidos a óxido de cobre (I) insolúvel), ao passo que não deverá ocorrer alteração de cor com a sacarose ou o amido. A solução de proteína deverá ficar violeta pálido.

b) Detecção de amido (soluto de Lugol)

1. Pipetar uma amostra de 500 μl das soluções A a E para cada um de cinco tubos de ensaio.
2. Adicionar 50 μl de soluto de Lugol a cada tubo de ensaio e observar a reacção colorida.

O soluto de Lugol é um indicador para testar a presença de amido. O corante irá colorir o amido à medida que interage com a estrutura enrolada do polissacarídeo, produzindo uma cor azul escura. Não reage com os monossacarídeos (glicose) nem com os dissacarídeos (lactose ou sacarose).

c) Detecção de proteína

O ensaio da proteína baseia-se no teste de Bradford que mede a alteração de cor do corante Azul Brilhante de Coomassie quando ele se liga à proteína.

1. Pipetar uma amostra de 20 μl das soluções A a E para cada um de cinco tubos de ensaio, e adicionar 800 μl de água desionizada e 200 μl de corante Azul Brilhante de Coomassie (reagente de Bradford).
2. Misturar os reagentes, deixar reagir durante 5 minutos e observar a reacção colorida.

Na presença de proteína, a solução muda para a cor azul (esta pode ser medida num fotómetro a 595 nm). As amostras que contêm açúcar ou amido não mudarão de cor.

Nota de segurança: A solução para teste de proteína da Biorad contém metanol e ácido fosfórico e deve, por isso, ser usada com cuidado.

Resultados e interpretação

A solução B dá reacção positiva com o soluto de Lugol, revelando, deste modo, que contém amido. A solução D dá reacção positiva com o teste de Bradford, revelando ser uma solução proteica. As soluções A e C produzem um precipitado avermelhado durante a reacção de Fehling e podem, portanto, ser identificadas como as amostras dos açúcares redutores glicose e lactose (apesar de não ser possível nesta fase dizer qual é qual). A solução que resta, E, não mostra reacção em nenhum dos tubos e deve portanto ser a solução de sacarose.

Experiência 2: identificação enzimática do açúcar

Nesta segunda experiência, as duas últimas soluções A e C são novamente testadas, para verificar qual delas contém lactose e qual contém glicose. Para esta experiência usamos o kit disponível no mercado, Enzyplus EZS 962+ lactose/D-glucose, que pode ser adquirido na BioControl^w2. Este procedimento é semelhante ao vulgarmente usado por doentes com diabetes para monitorizar os seus níveis de glicose no sangue. O protocolo standard para o produto foi alterado e reduzido, para que um grande número de experiências possa ser realizado com os reagentes disponibilizados. Um kit contém materiais suficientes para 20 pares de alunos.

O princípio do teste é o seguinte (ver figuras abaixo):

• O dissacarídeo lactose é hidrolisado pela enzima β-galactosidase em D-galactose e D-glicose (Passo 1 abaixo).


• Na presença de ATP, a D-glicose é fosforilada pela hexoquinase em glicose-6-fosfato; simultaneamente, forma-se adenosina-5´-difosfato (ADP) (Passo 2).


• A glicose-6-fosfato é oxidada pela glicose-6-fosfato desidrogenase em gliconato-6-fosfato.


• No curso desta reacção, o NADP⁺ is reduced to NADPH é reduzido a NADPH. A quantidade de NADPH formado nesta reacção está em equilíbrio estequiométrico com a quantidade de lactose e pode ser medida por fotometria pelo aumento da absorvância a 340 nm.

Text

Para efectuar esta reacção:

1. Pegar em quatro tubos de ensaio de 1.5 ml e rotulá-los A+, A-, C+ e C-. Colocar 100 µl de solução tampão R4b (tampão fosfato pH 6.6) em cada tubo, e juntar 5 µl de solução R4a b-galactosidase nos tubos A+ e C+ (não nos tubos A- ou C-).
2. Juntar 100 µl de solução A aos tubos A+ e A- e 100 µl de solução C aos tubos rotulados C+ e C-.

Nota: Nos restantes passos desta experiência, todas as quatro amostras têm idêntico tratamento.

1. Deixar todas as amostras em banho-maria durante 30 minutos a 37º C, enquanto a hidrólise da lactose ocorre.
2. Após a incubação, juntar 1 ml de água destilada, 200 µl de solução tampão R1 e 50 µl de reagente R2 (contendo ATP e NADP, respectivamente) aos quatro tubos de ensaio e agitar bem.
3. Tranferir 1 ml de cada mistura para cuvetes de fotómetro separadas e medir a densidade óptica a 340 nm (OD340) após 2 minutos.
4. A cada cuvete juntar 7 µl da mistura enzimática R3 contendo a hexoquinase e a glicose-6-fosfato-desidrogenase, incubar durante mais 5 minutos, e medir novamente a absorvância a 340 nm.

Resultados e interpretação

Todas as amostras devem apresentar baixos valores de absorção na primeira medição, indicando a ausência de NADPH. A segunda medição (após a adição das enzimas) deve permitir distinguir as soluções A e C. Como a solução A dá resultados positivos independentemente da adição ou não de b-galactosidase, pode concluir-se que contém glicose. Ao contrário, uma alteração na absorção da solução C deve apenas verificar-se na presença de b-galactosidase (C+), indicando que contém lactose.

Durante a aula prática, os participantes adquirem conceitos básicos sobre diabetes e os problemas que os doentes com diabetes enfrentam. Para monitorizar os níveis de glicose no sangue, os doentes usam um sistema constituído por uma fita-teste que funciona como uma “caixa negra” mas se baseia no princípio usado na Experiência 2. A realização destas experiências pode sensibilizar para a diabetes e como se pode sobreviver à doença, ou evitá-la, através da modificação do estilo de vida.

As experiências aqui descritas podem ser realizadas com segurança nos vulgares laboratórios das escolas, já que os reagentes utilizados não são materiais perigosos, de acordo com o Hazardous Substances Regulations (EC Regulation 67/548/EEC). O nível de azida de sódio, o conservante presente nos reagentes, é inferior ao nível mínimo de toxicidade, de acordo com a Directiva 1999/45/EC.

Referências

Dugi K (2006) Diabetes mellitus. Science in School 1: 61-65. www.scienceinschool.org/2006/issue1/diabetes

Referências da Internet

w1 – Biorad: www.bio-rad.com

w2 – BioControl: www.rapidmethods.com

w3 – ExploHeidelberg: www.explo-heidelberg.de

w4 – University of Education Heidelberg: www.ph-heidelberg.de