Tradotto da Monica Mauri

Immagine per gentile concessione di Hemera Photo Objects

Dean Madden del National Centre for Biotechnology Education (NCBE), Università di Reading, UK, propone un esperimento per ottenere latte privo di lattosio – utile sia per i gatti che per il 75% della popolazione mondiale che risulta intollerante a questo tipo di zucchero.

Scopi

Questa semplice prova pratica fa conoscere agli studenti i concetti fondamentali della digestione e dell’immobilizzazione degli enzimi. Può essere utilizzata come punto di partenza per altre attività di livello più avanzato, come ad esempio la regolazione della produzione della lattasi nell’ Escherichia coli (l’operone lac), l’evoluzione e l’importanza sociale della tolleranza al lattosio per le persone, e l’uso degli enzimi nella produzione degli alimenti.

Introduzione

La Lattasi (beta-galattosidasi) catalizza l’idrolisi del lattosio a glucosio e galattosio:

Lattosio-> D-glucosio + beta-D-galattosio

Entrambi questi zuccheri sono più dolci è più prontamente digeribili del lattosio. Malgrado la loro proverbiale passione per il latte, i gatti non sono in grado di digerire grandi quantità di lattosio. Il latte può essere trattato con l’enzima per ottenere un latte a ridotto contenuto di lattosio adatto per i gatti o per le persone intolleranti al lattosio^w1.

Anche se la produzione di un latte speciale ‘per gatti’ può sembrare una cosa di scarsa importanza, si stima che il 75 % della popolazione mondiale sia intollerante al lattosio nell’età adulta – e quindi è la tolleranza per il lattosio ad essere insolita.

Industrialmente, il latte viene trattato iniettando un enzima nell’imballaggio quando il latte UHT viene confezionato, o utilizzando un enzima immobilizzato – un enzima che è stato intrappolato su di un materiale inerte in modo da poterlo usare ripetutamente.

In questa attività, gli studenti immobilizzano la lattasi in sferette (o perle) di alginato di calcio contenute in una piccola colonna, attraverso la quale viene fatto passare il latte.

Attrezzature e materiali

Occorrente per ciascuna persona o gruppo:

Attrezzature

• Un pezzetto (circa 1 cm2) di garza di nylon, ad esempio un tessuto per tende
• Una siringa di plastica da 10 ml (senza ago)
• Un tubo per l’aria da acquario o un tubo di silicone del diametro di 4 mm, lungo circa 7 cm, da infilare sulla siringa
• Un rubinetto per il tubo dell’aria per acquario o una pinza regolabile per tubi da laboratorio (pinza di Hoffmann)
• Sostegno, pinza e morsetto (per sostenere la colonna contenente l’enzima)
• 2 piccoli beakers (100 ml) o bicchieri di plastica monouso
• Un colino da tè
• Agitatore di vetro

Materiali

• 2 ml di enzima lattasi (Novozymes^w3 Lactozym^®)
• 8 ml di soluzione di alginato di sodio al 2%
• 100 ml di soluzione di cloruro di calcio all’1.5 %
• 50 ml di latte (not UHT milk)
• Strisce reattive al glucosio semi-quantitative (es. Roche Diabur-Test 5000 o Ames Diastix)

Nota: Tutte le soluzioni devono essere preparate utilizzando acqua distillata o deionizzata. L’alginato di sodio non è immediatamente solubile, e per disciogliersi richiede sia dell’acqua calda che l’agitazione.

Preparazione e gestione del tempo

Quest’attività richiede circa 40 minuti. L’alginato di sodio impiega un po’ di tempo a sciogliersi, quindi è meglio preparare la soluzione prima della lezione. L’enzima immobilizzato, volendo, potrebbe essere preparato in anticipo; le sferette dovrebbero essere tenute in frigorifero, sebbene non si conservino più di qualche giorno.

Procedimento

1. Mescolare l’enzima con la soluzione di alginato di sodio. Poi aspirarlo in una siringa da 10 ml.


2. Aggiungere la miscela alginato – enzima dalla siringa, una goccia alla volta, alla soluzione di cloruro di calcio e osservare la formazione di piccole sfere. Non consentire alla punta della siringa di venire in contatto con la soluzione di cloruro di calcio, poiché questo provocherebbe l’indurimento dell’alginato, bloccando l’uscita. Le sferette, che contengono l’enzima immobilizzato in una matrice di alginato di calcio, dovrebbero essere lasciate indurire per alcuni minuti.


3. Attaccare un piccolo tratto di tubo alla punta del cilindro di una siringa. Collocare un dischetto di garza di nylon all’interno del cilindro, per impedire alle sferette di bloccare l’uscita della siringa.


4. Separare le sferette di enzima immobilizzato dal liquido con il colino da tè.

5. Versare con cura le sferette nel cilindro della siringa.


6. Chiudere il tubicino infilato sul cilindro della siringa usando una pinza per tubi.


7. Testare il latte prima del trattamento usando le strisce reattive al glucosio, per essere sicuri che esso non contenga affatto glucosio.


8. Versare una piccola quantità di latte sulle sferette di enzima, poi togliere la pinza e lasciar scendere il latte trattato in un piccolo beaker.


9. Testare il latte fuoriuscito dalla colonna usando le strisce reattive al glucosio. Se necessario, far passare nuovamente il latte trattato nella colonna fino a che non si sia ottenuta la concentrazione di glucosio desiderata.

Indicazioni di Sicurezza

Non bere il latte

L’enzima consigliato per questo lavoro è sicuro da usare, a patto che venga manipolato in modo appropriato. Sebbene Novozymes Lactozym® sia un prodotto per uso alimentare, il latte preparato utilizzandolo non dovrebbe essere consumato. Questo perché l'enzima non è stato manipolato asetticamente, ed in questo modo esso (ed il prodotto che con esso è stato ottenuto) potrebbe essere stato contaminato.

I lettori sono avvertiti di fare riferimento a tutte le direttive di sicurezza locali e di effettuare le loro proprie valutazioni dei rischi per ogni lavoro pratico.

Indicazioni generali di sicurezza sugli enzimi

Poiché gli enzimi sono idrosolubili, bisognerebbe sempre usare acqua per rimuoverli se vengono dispersi.

Immagine per gentile concessione di Dean Madden

Non lasciar essiccare le preparazioni liquide di enzimi Se le preparazioni liquide vengono lasciate essiccare, c’è il rischio di formazione di polveri. In soggetti sensibili, la ripetuta inalazione di queste polveri potrebbe provocare asma o una reazione simile alla febbre da fieno. Ogni versamento – sull’attrezzatura, sul pavimento o sul banco – dovrebbe essere immediatamente sciacquato via con acqua.

Evitare la formazione di aerosol

Se si formano aerosol contenenti l’enzima, esiste un rischio di inalazione dell’enzima. In soggetti sensibili, la ripetuta inalazione di questi aerosol potrebbe provocare asma o febbre da fieno. Per questo motivo, le preparazioni enzimatiche non dovrebbero mai essere spruzzate.

Evitare il contatto diretto con pelle e occhi

Se accidentalmente la vostra pelle o i vostri occhi vengono a contatto con l’enzima liquido, il rimedio è molta acqua corrente. Lo stesso vale per gli indumenti. In caso di versamento sui vestiti, sciacquarli con acqua, e quindi lavarli normalmente. Questo trattamento di solito si rivela sufficiente, ma se si manifestano sintomi che interessano le vie respiratorie, o la pelle o gli occhi, consultare immediatamente un medico.

Individuazione degli errori

Qualche latte UHT darà esiti positivi al test del glucosio, probabilmente perché il trattamento a caldo idrolizza parte del lattosio. Perciò bisognerebbe evitare di utilizzare il latte UHT.

Ulteriori accertamenti

La colonna con l’enzima immobilizzato potrebbe essere utilizzata anche per trattare il siero del latte, producendo un dolce sciroppo di siero di latte che è ampiamente utilizzato in pasticceria (è di solito indicato nelle etichette come “sciroppo di siero di latte idrolizzato” o semplicemente “sciroppo di siero di latte”). La Lattasi è fortemente inibita dal galattosio (uno dei prodotti della sua azione sul lattosio). Di conseguenza, la velocità del flusso del substrato attraverso la colonna è critica per la velocità della reazione catalizzata dall’enzima: se il flusso è troppo veloce non c’è il tempo per far avvenire la reazione; se è troppo lento il galattosio si accumula ed inibisce la reazione. Gli studenti possono quindi studiare gli effetti della velocità del flusso sulla conversione del lattosio a glucosio e galattosio.

Immagine per gentile concessione di Dean Madden

Fornitori

L' NCBE^w2 fornisce prodotti enzimatici^w3 Novozymes a scuole e college del Regno Unito. Accordi simili potrebbero esistere anche in altri Paesi.

Conservazione dei materiali

Le preparazioni enzimatiche dovrebbero essere conservate, non diluite, a 3-4 °C.

Fonti sul web

w1 – Un’esauriente descrizione dell’intolleranza al lattosio può essere reperita su Wikipedia: http://en.wikipedia.org/wiki/Lactose_intolerance

w2 – Il National Centre for Biotechnology Education (NCBE) nel Regno Unito offre risorse didattiche tirocini pratici per insegnanti in alcuni Paesi dell’Unione Europea. Vedere: www.ncbe.reading.ac.uk

w3 – Per il sito web della Novozymes A/S, Denmark, vedere: www.novozymes.com

w4 – Questo ed altri protocolli sono disponibili per il download dal sito web del Volvox: www.eurovolvox.org

Fonti

Bayless TM, Paige DM, Ferry GD (1971) Lactose intolerance and milk drinking habits. Gastroenterology 60: 605–608.

Richmond ML, Gray JI, Stine CM (1981) Beta-galactosidase: Review of recent research related to technological application, nutritional concerns and immobilization. Journal of Dairy Science 64: 1759–1771.

Woodward J (ed; 1985) Immobilised enzymes and cells: a practical approach. Oxford, UK: Oxford University Press. ISBN: 0947946217. (An academic laboratory manual describing methods of immobilising enzymes and cells)

Ringraziamenti

Questo protocollo pratico è stato adattato per il progetto Volvox^w4, che è finanziato dal Sixth Framework Programme della Commissione Europea.

Dean Madden è un biologo che lavora presso il National Centre for Biotechnology Education (NCBE) all’Università di Reading, UK. L’ NCBE fu istituito nel 1984 e da allora ha conquistato una fama internazionale per lo sviluppo di risorse didattiche innovative; i suoi materiali sono stati tradotti in molte lingue, tra le quali Tedesco, Svedese, Francese, Olandese e Danese.